5-Aza诱导BM-MSCs移植对大鼠心肌梗死面积、相关细胞因子及钾离子通道蛋白的影响

李明阳，王淑霞，赵静苗，王秋萍，陈 凭，金 华，胡继宏

(甘肃中医药大学 1.公共卫生学院； 2.基础医学院； 3.科研实验中心，甘肃 兰州 730000；4.兰州市第二人民医院 体检中心， 甘肃 兰州 730000)

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是全球范围内致死的主要疾病之一。急性心梗后的心律失常、心力衰竭是常见合并症，也是致死的主要原因[1]。传统的治疗方法(如介入治疗、溶栓治疗、外科治疗等)虽然能够改善疾病状况，减少死亡，但均不能逆转已经坏死的心肌细胞。为此，干细胞移植有望成为防止和逆转心力衰竭的一个有效途径，其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)在许多心脏疾病(如心肌梗死和心肌肥厚)的治疗中发挥着越来越普遍的作用。BM-MSCs移植可以通过心肌细胞的再生以及旁分泌作用促进血管生成、减少心肌纤维化、阻止宿主心肌细胞凋亡来改善受损的心功能[2]。梗死区内部及梗死周边区尚存活的心肌细胞膜离子通道功能改变，可能是导致梗死后出现心律失常的原因[3]。前期研究发现BM-MSCs移植对心肌梗死区的钾离子通道蛋白Kv1.5和Kv1.2的表达有一定影响[4]。5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-Aza)作为BM-MSCs公认的定向诱导剂，5-Aza诱导BM-MSCs移植对钾离子通道蛋白、炎性因子以及前列环素的影响尚不清楚。本研究旨在系统探讨5-Aza诱导BM-MSCs移植对心肌钾离子通道蛋白及心梗相关细胞因子(炎性因子、细胞凋亡因子、自噬因子)的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞SPF级雄性Wistar大鼠，2月龄，50只，体质量(180±22)g，[甘肃中医药大学许可证号：SCXK(甘)2015-0005]；大鼠骨髓间充质干细胞BM-MSCs第2代(北京医科利昊生物科技有限公司)。

1.1.2 实验试剂：5-氮杂胞苷(Sigma-Aldrich 公司)；Western blot试剂盒(Solarbio公司)；Western blot 一抗(Abcam公司)；Western blot 二抗、beclin-2抗体、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；间充质干细胞培养基(MSCM)(ScienCell公司)；caspase-3抗体[安诺伦(北京)生物科技有限公司]；IL-3抗体、PGI2抗体(北京索莱宝科技有限公司)； IL-6抗体、TNF抗体(武汉六合生物技术有限公司)；VEGF抗体(广州联科生物技术有限公司)；超氧化物歧化酶抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将分为对照组、模型组、阴性对照组、BM-MSCs组、5-Aza-BM-MSCs组，每组10只。除对照组外，均用冠状动脉结扎建立心梗模型[5]，模型成功后15～20 min，模型组不注射任何溶液；阴性对照组注射100 μL细胞培养液；BM-MSCs组移植等量单纯的BM-MSCs(1×106个/100 μL)；5-Aza-BM-MSCs组在细胞生长至80%～90%汇合时进性细胞传代，加入等量浓度为10 μmol/L的5-Aza诱导24 h，移植时用1 mL注射器在梗死心肌周围分4点注射至心尖部，前期体外实验已经发现5-Aza诱导可分化为心肌样细胞[6-7]。

1.2.2 心肌梗死面积的检测：取心尖组织以4%多聚甲醛固定，HE染色，采用Image J软件计算梗死面积百分比，心肌梗死面积=梗死区域/总区域×100%。

1.2.3 免疫组化法检测：取心尖组织，检测细胞凋亡因子caspase-3和自噬因子beclin-2、血管内皮生长因子VEGF、PGI2和氧化应激因子SOD；炎性反应因子IL-3、IL-6和TNF-α，利用Image J 软件定量分析。

1.2.4 Western blot检测：取心尖组织，Western blot分别加入Kv1.2、Kv1.5的一抗和二抗，用ECL发光显色后，将PVDF膜放入数码凝胶图像分析仪进行曝光，所得图片采用Image J件进行扫描，以β-actin为内参蛋白，计算相应的蛋白含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 心肌梗死面积

与对照组相比，模型组心肌梗死面积增大(P<0.05)；与模型组相比，BM-MSCs组和5-Aza-BM-MSCs组心肌梗死面积均减少，5-Aza-BM-MSCs组较BM-MSCs组明显减少(P<0.05)(图1)。

2.2 细胞凋亡和自噬因子

与对照组相比，模型组caspase-3和beclin-2的表达均上升(P<0.05)；与模型组相比，BM-MSCs组和5-Aza-BM-MSCs组caspase-3和beclin-2的表达降低(P<0.05)；与BM-MSCs组相比，5-Aza-BM-MSCs组的caspase-3表达降低(P<0.05)(图1)。

2.3 血管内皮细胞生长因子VEGF、PGI2和SOD的表达

与对照组相比，模型组VEGF和PGI2表达上升，而SOD表达降低(P<0.05)；与模型组相比，BM-MSCs组和5-Aza-BM-MSCs组VEGF、PGI2和SOD表达上升(P<0.05)；5-Aza-BM-MSCs组的VEFG和SOD较BM-MSCs组升高(P<0.05)(图2)。

2.4 炎性细胞因子IL-3、IL-6和TNF-α表达结果

与对照组相比，模型组的IL-3、IL-6和TNF-α含量表达上升(P<0.05)；与模型组相比，BM-MSCs组和5-Aza-BM-MSCs组的IL-3、IL-6和TNF-α含量表达降低(P<0.05)；5-Aza-BM-MSCs组的IL-6较BM-MSCs组表达降低(P<0.05)(图3)。

2.5 钾离子通道蛋白Kv1.2和Kv1.5的表达结果

与对照组相比，模型组的Kv1.2和Kv1.5表达降低(P<0.05)。与模型组相比，BM-MSCs组的Kv1.2表达下降,而5-Aza-BM-MSCs组表达上升(P<0.05);BM-MSCs组和5-Aza-BM-MSCs组的Kv1.5表达上升 (P<0.05)。与BM-MSCs组相比，5-Aza-BM-MSCs组的Kv1.2表达上升(P<0.05)(图4)。

3 讨论

心血管疾病严重影响人类健康，根据《中国心血管病报告 2018》显示，中国心血管病患病率持续上升，并且病死率居首位。心肌自我再生能力有限，并不足以弥补梗死区域的心肌细胞坏死和丢失。BM-MSCs移植可通过旁分泌和转分化的方式增加新生血管，提高血管密度，改善心功能，减少心肌梗死面积[2]。5-Aza诱导BM-MSCs更有利于心肌细胞存活及病理改善。影响梗死面积大小的主要因素是细胞凋亡，其中caspase-3是细胞凋亡的主要效应因子和执行者。心肌梗死时，BM-MSCs可抑制caspase-3的表达降低细胞凋亡[8]，同时VEGF 和SOD具有抗凋亡，增强抗氧化，减少心梗面积[9-10]。本研究显示，BM-MSCs移植不仅抑制caspase-3表达，且促进VEGF和SOD高表达，这可能是减少心梗面积的重要原因之一。另外，BM-MSCs具有独特的免疫抑制和炎性反应调节作用，BM-MSCs移植可以降低促炎因子TNF-α和 IL-6 的表达，改善心脏功能，减小梗死面积[11]。5-Aza诱导BM-MSCs移植也可促进IL-6和caspase-3低表达、VEGF和SOD高表达，提示5-Aza诱导BM-MSCs可能通过促进血管内皮因子生成，减少炎性反应， 抑制细胞凋亡的表达，从而减少心梗面积。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group图1 细胞移植4周后各组心肌梗死面积、细胞凋亡因子caspase-3及细胞自噬因子beclin-2比较Fig 1 Comparison of myocardial infarct size, cell apoptosis factor caspase-3 and cell autophagy factor beclin-2 in each group 4 weeks after cell transplantation(immunohistochemical, ×200)

心梗后的心律失常最重要机制是梗死灶、边缘区和存活心肌组织共存而引起的电生理异质性，同时氧化应激可促进心律失常的发生。钾离子通道蛋白是维持正常心电活动的主要离子通道，与心律失常的发生、发展密切相关；钾离子通道蛋白Kv1.5与房性心律失常有关，也参与细胞的增殖、凋亡及炎性反应等病理过程[12]， 阻断Kv1.5通道， 上调caspase-3表达，增加SOD活性，可以促进BM-MSCs活性[10,12-13]，SOD与TNF-α成负相关，TNF-α可降低Kv1.5的表达，引起心律失常[14]。本研究BM-MSCs移植降低caspase-3和TNF-α表达，提高SOD和Kv1.5表达，提示BM-MSCs移植可能通过caspase-3、 SOD和TNF-α影响Kv1.5的表达， 而对Kv1.2表达下降影响的机制尚待进一步研究探索。另外，5-Aza诱导可促使部分BM-MSCs分化为表达延迟整流钾电流心肌样细胞，促进钾离子通道成熟[15]，Kv1.5和Kv1.2均为延迟整流钾电流， 且Kv1.5 mRNA的表达不受5-Aza的影响[16]，与本研究结果类似，提示5-Aza诱导BM-MSCs可促进Kv1.2高表达，对Kv1.5无影响。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group图2 干预4周后各组心肌梗死区VEGF、PGI2和SOD比较Fig 2 Comparison of VEGF, PGI2, and SOD in myocardial infarction area after 4 weeks of intervention (immunohistochemistry, ×200)

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group图3 细胞移植4周后各组炎性因子IL-3、IL-6和TNF-α比较Fig 3 Comparison of inflammatory factors IL-3, IL-6 and TNF-α in each group 4 weeks after cell transplantation (immunohistochemistry, ×200)

综上所述， BM-MSCs可能通过caspase-3、 SOD和TNF-α影响Kv1.5的表达；5-Aza诱导BM-MSCs可通过促进VEGF和SOD，降低IL-6和caspase-3表达而减少心肌梗死面积，并促进Kv1.2高表达。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with BM-MSCs group图4 细胞移植钾离子通道Kv1.2和Kv1.5蛋白的比较Fig 4 Comparison of Kv1.2 and Kv1.5 proteins of potassium ion channel in cell n=10)