黄芪主要成分对TGF-β1诱导大鼠睾丸Leydig细胞系合成雌二醇的影响

李彦荣，刘光炜，赵 晶，李亚军

(1.甘肃中医药大学(定西校区)，甘肃 定西 743000； 2.定西市人民医院 检验科，甘肃 定西 743000)

雄性动物的血清、睾丸网以及精液中都存在着一定浓度的雌激素，而以睾丸网液中的雌激素水平为高，甚至可以达到250 ng/L，雌激素对雄性生殖系统的正常发育和功能的维持也起着非常重要的作用[1]。多种因素会导致睾丸损伤，如：镉、射线、高温和氧自由基等，这些因素使睾丸Leydig细胞受到损伤，这种损伤影响到精子的生成，导致男性生殖功能障碍，男性不育症患者逐年增多[2-4]。黄芪是中国传统的中药材，始载于《神农本草经》，为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongho licus (Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，味甘、微温、归肺和脾经[5]，具有补中益气，扶正固本之功效。黄芪中主要成分:总黄酮(Astragalus flavone)、总皂苷(Astragalus saponin)及总多糖(Astragalus polysaccharide)对睾丸Leydig细胞具有保护作用[6-9]。转化生长因子β1(TGF-β1)对大鼠睾丸Leydig细胞中雌、雄激素分泌均有明显抑制作用[10]。本实验探讨在黄芪中哪种成分对损伤睾丸Leydig细胞合成雌二醇(estradiol,E2)作用效果最佳。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

大鼠睾丸Leydig细胞系(北京北纳创联生物技术研究院)；胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司)；胰蛋白酶(YEASEN公司)；RPMI1640培养基(Hyclone公司)；TGF-β1细胞因子(Peprotech公司)；大鼠雌二醇(estradiol，E2)ELISA试剂盒、大鼠细胞色素P450芳香化酶(P450arom)ELISA试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司)；黄芪总黄酮、黄芪总皂苷、黄芪总多糖(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 Leydig细胞的培养及分组处理：用RPMI1640完全培养基(90% RPMI1640基础培养基，10%胎牛血清)，在5% CO2、37 ℃培养箱中传代培养睾丸Leydig细胞。将细胞分对照组、模型组(5 ng/mL TGF-β1造模)和中药干预组。根据参考文献[10]和预实验的结果，将中药干预组分为：低和高剂量黄芪总黄酮组(终浓度为10和50 mg/L)；低和高剂量黄芪总皂苷组(终浓度为20和100 mg/L)；低和高剂量黄芪总多糖组(终浓度为10和100 mg/L)。

1.2.2 细胞爬片：用血细胞计数板进行细胞计数，然后按照5×104个/mL的浓度稀释细胞，在6孔细胞培养板中预先放置好无菌的盖玻片，将稀释好的细胞按每孔2 mL接种到6孔板中。

1.2.3 ELISA检测E2、P450arom及细胞爬片染色：每组细胞加药48 h后取出细胞，收集细胞上清液，严格按ELISA试剂盒说明书对E2、P450arom进行检测，细胞爬片用PBS洗涤2遍，多聚甲醛固定1/2 h，进行HE染色，然后用显微镜观察。

1.2.4 细胞的计数：将细胞放大200倍进行观察，每张细胞爬片随机选取5个视野，用Imagej-win64软件进行细胞计数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪主要成分对睾丸Leydig细胞合成E2、P450arom的影响

和正常组比较，模型组睾丸Leydig细胞中的E2含量降低26.14%, P450arom蛋白含量降低50.56%。和模型组比较，黄芪总黄酮(10和50 mg/L)、黄芪总皂苷(20和100 mg/L)、黄芪总多糖(10和50 mg/L)使睾丸Leydig细胞中的E2含量分别升高14.56%、19.77%、37.51%、13.61%、26.03%和1.54%，P450arom含量分别升高2.50%、27.56%、0.57%、10.74%、27.14%和24.23%(表1)。

表1 黄芪主要成分对睾丸Leydig细胞合成E2、P450arom的影响Table 1 Effects of different Atragalus compositions on E2 and P450arom composition in Leydig cells

2.2 HE染色观察睾丸Leydig细胞形态

模型组较正常组细胞数量显著减少，细胞呈多种形态，以梭形、多角形细胞为主，核染色较深，核仁不清楚。中药干预组细胞数量明显多于模型组，但少于正常组，胞体呈圆形、多边形、梭形、多角形,以圆形和多边形细胞为主，部分可见核仁(图1)。

2.3 黄芪主要成分对TGF-β1损伤睾丸Leydig细胞数量的影响

将TGF-β1作用于模型组Leydig细胞后，与模型组、实验组细胞和正常组细胞相比形态异常，数量减少(P<0.01)。黄芪总黄酮、黄芪总皂苷、黄芪总多糖干预后，实验组细胞病变改善明显，和模型组相比，细胞数量明显增多(P<0.01)(表2)。

3 讨论

雄性动物的血清、睾丸网以及精液中都存在着一定浓度的雌激素。雌激素不仅对雌性生殖系统的结构和功能至关重要，对雄性生殖系统的正常发育和功能的维持也同样起着非常重要的作用[11]。睾丸Leydig细胞占睾丸细胞总数的2%～4%，是睾丸中的内分泌细胞。P450arom作用于睾丸Leydig细胞、支持细胞和生殖细胞。成熟Leydig细胞中的P450arom在绒促性素诱导将合成的T转化成E2[10]。当Leydig细胞损伤或P450arom表达及活性降低时， Leydig细胞合成E2减少甚至不合成，精子的发生就会受到影响。

图1 黄芪主要成分对各组细胞形态的影响Fig 1 Effects of different Astragalus compositions on cellular morphology in each group (HE，×200)

表2 黄芪主要成分对TGF-β1损伤睾丸Leydig细胞的影响Table 2 Effects of different Atragalus compositions on TGF-β1-induced Leydig cells numbers

临床实践和文献检索发现，黄芪及其主要成分对睾丸和Leydig细胞具有保护作用。黄芪总黄酮具有较强的抗辐射作用，能显著提高受致死剂量60Co-γ射线照射小鼠的存活率，降低辐射对小鼠外周血WBC和PLT及脾脏的损伤作用[7]。黄芪多糖可能通过清除氧自由基及抗脂质过氧化的机制，减轻大剂量射线对睾丸间质细胞表面的损伤[7-8]。黄芪总皂苷能够有效降低糖尿病大鼠空腹血糖，能提高身体质量和睾丸指数，提高血清睾酮含量，改善睾丸组织生化指标，改善抗氧化酶活性、降低氧化应激损伤，改善睾丸组织病变和细胞超微结构改变，提示黄芪总皂苷对糖尿病大鼠睾丸组织具有保护作用[9，12]。

TGF-β1在人睾丸表达的研究表明：TGF-β1可表达于人睾丸的间质细胞、支持细胞与生精细胞。TGF-β1是一种间质细胞的局部调节因子，通过自分泌和旁分泌方式，在睾丸的发育与成熟和精子发生过程中发挥着重要作用[13]。TGF-β1对大鼠睾丸Leydig细胞中雌、雄激素分泌均有明显抑制作用[10]。

通过文献检索，尚未有黄芪主要成分对损伤睾丸Leydig细胞合成E2作用效果最佳成分的研究报道。本实验采用TGF-β1对体外培养的睾丸Leydig细胞进行模型构建，以黄芪总黄酮、黄芪总皂苷和黄芪总多糖分别对TGF-β1损伤的睾丸Leydig细胞进行干预。实验发现，三者均能缓解TGF-β1抑制睾丸Leydig细胞分泌E2、P450arom的作用，终浓度20 mg/L黄芪总皂苷缓解TGF-β1抑制睾丸Leydig细胞合成E2的作用最明显，终浓度50 mg/L的黄芪总黄酮缓解TGF-β1抑制睾丸Leydig合成P450arom的作用最明显；三者均能改善睾丸Leydig细胞病变，促进Leydig细胞的增殖，20 mg/L黄芪总皂苷促使TGF-β1诱导下Leydig细胞的增殖效果最显著。