血浆miR-93、miR-144检测在食管癌患者预后评估中的价值

徐露娟，洪永贵，宋学坤，郭胜男，曹 恒，温艳艳

1.安阳市肿瘤医院内一科，河南 安阳 455000；2.河南中医药大学健康大数据与生物医学信息学实验室

世界范围内食管癌发病率在36种癌症中排第7位，死亡率排第6位，而中国食管癌发病率为全球前五，远高于世界平均水平[1]。多数食管癌患者确诊时已为中晚期，手术及放化疗效果较差，导致预后极差、生存率较低[2]。微小RNA是一类高度保守的内源性小型非编码调控核糖核酸，Ansari等[3]发现，miR-93在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)肿瘤组织中表达显著高于非肿瘤组织，认为miR-93可能在ESCC中发挥重要作用，miR-93可用作ESCC的潜在生物标志物。Xie等[4]发现，miR-144在食管癌患者唾液中的表达水平较健康对照组上调。Du等[5]研究认为，miR-144在食管癌患者唾液中可能靶向Notch同源物1，已知Notch同源物1作为心脏特异性靶标可引起心脏异常，在右心室形态发生改变过程中有一定作用[6]。但miR-93、miR-144表达情况与食管癌患者预后关系的相关研究较少，因此本研究针对miR-93、miR-144在食管癌患者血浆中的表达水平，探讨二者与食管癌患者预后情况的关系，以期未来可对食管癌预后评估提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2017年6月至2019年6月经本院检查并确诊为食管癌的患者64例作为观察组，男35例，女29例，年龄(49.21±8.13)岁(45～55岁)；按照美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)关于食管癌的TNM分期系统(第八版)[7]对患者进行TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期31例。另选取同期在本院体检的健康者60名作为对照组，男33例，女27例，年龄(47.25±9.51)岁(43～54岁)。两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。观察组入选标准：(1)经病理组织学或细胞学诊断为食管癌；(2)入组患者均行食管癌根治术，且就诊前未行手术、放射、化疗或激素治疗；(3)患者肿瘤为原发；(4)临床资料完整。排除标准：(1)心、脑、肾等重要器官功能障碍；(2)急性、亚急性或隐性感染性疾病；(3)凝血系统障碍，有出血疾病者；(4)合并其他部位肿瘤疾病者。所有受试者均对本研究知情同意并自愿签署知情同意书，本研究获本院医学伦理委员会审查批准(伦理批号：201705-12)。

1.2 主要试剂与仪器逆转录试剂盒(货号：DEM201-20T)购自北京拜尔迪生物技术有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(货号：RR037A)及TRIzol试剂(货号：JMS12279)均购自日本TaKaRa公司；实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：MiniAmp)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集：两组测试对象均于早晨空腹采集静脉血6 ml，肝素抗凝，室温静置2 h，4 000 r/min离心10 min，吸取上层淡黄色血浆转移至新离心管中，均于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 qRT-PCR法测定受试者血浆中miR-93、miR-144表达水平：从-80 ℃冰箱取出血浆样本，按试剂盒说明书提取血浆总RNA，异丙醇沉淀浓缩后，用75%酒精洗涤，干燥后加入100 μl DEPC水，检测所得RNA纯度及完整度；按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，产物置于-20 ℃保存。qRT-PCR反应(反应体系10 μl)：cDNA(50 ng/μl)模板1 μl，SYBR Green PCR Master Mix 4.5 μl，上下游引物各0.4 μl，无酶水3.7 μl，每个样本设置3个平行。上下游引物由上海恒斐生物科技有限公司设计并合成，miR-93、miR-144以RUN6B为内参，引物序列见表1，反应条件：95 ℃预变性6 min；95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，每个循环72 ℃收集荧光。采用2-ΔΔCt法计算血浆中miR-93、miR-144相对表达量。

表1 miR-93、miR-144基因qRT-PCR引物序列Tab 1 qRT-PCR primer sequence of miR-93 and miR-144 genes

1.4 随访及预后评价以患者手术时间为观察起点，患者死亡、失访或最后一次随访时间为终点，通过电话、微信等联系方式进行随访，每30 d随访1次，记录患者死亡原因。

2 结果

2.1 两组一般资料比较两组患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、热食、食管癌家族史比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 两组一般资料比较Tab 2 Comparison of general data between two groups

2.2 两组血浆中miR-93、miR-144表达水平观察组血浆中miR-93、miR-144 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)(见表3)。

表3 两组miR-93、miR-144表达水平比较Tab 3 Comparison of expression levels of miR-93 and miR-144 between the two groups

2.3ROC曲线分析食管癌患者血浆中miR-93、miR-144表达水平ROC曲线分析发现，区分食管癌患者血浆中miR-93、miR-144高低表达的截断值分别为1.70、2.05，低于截断值者为低表达组，高于截断值者为高表达组(见图1)。

图1 ROC曲线分析食管癌患者血浆中miR-93、miR-144表达水平Fig 1 ROC curve analysis of the expression levels of miR-93 and miR-144 in plasma of esophageal cancer patients

2.4 食管癌患者血浆中miR-93、miR-144表达水平与临床病理特征的关系食管癌患者血浆中miR-93、miR-144表达水平与年龄无关，与TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05)(见表4)。

表4 食管癌患者血浆中miR-93、miR-144表达与临床病理特征的关系Tab 4 The relationship between the expressions of miR-93, miR-144 in the plasma and clinicopathological characteristics of esophageal cancer patients

2.5 食管癌患者的预后比较对所有食管癌患者进行为期6个月的随访，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。miR-93高表达组28例，死亡15例；miR-93低表达组36例，死亡2例。食管癌患者miR-93低表达组6个月生存率明显高于高表达组(log-rank值为8.597，P=0.003)；miR-144高表达组37例，死亡14例；低表达组27例，死亡3例。食管癌患者miR-144低表达组6个月生存率明显高于高表达组(log-rank值为7.557，P=0.006)(见图2～3)。

图2 食管癌患者血浆miR-93表达与总生存率的关系Fig 2 The relationship between the expression of miR-93 and the overall survival rate in patients with esophageal cancer

图3 食管癌患者血浆miR-144表达与总生存率的关系Fig 3 The relationship between the expression of miR-144 and the overall survival rate in patients with esophageal cancer

2.6 影响食管癌患者预后的多因素分析COX多因素分析显示，miR-93高表达、miR-144高表达、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期是预测食管癌患者术后生存期的独立危险因素(P=0.002、0.024、0.036)(见表5)。

表5 影响食管癌患者预后的多因素分析Tab 5 Multivariate analysis of prognosis in patients with esophageal cancer

3 讨论

食管癌是一种常见的恶性肿瘤，我国的食管癌90%以上为ESCC，少数为腺癌。食管癌患者就诊时绝大多数已属于中晚期，目前食管癌的主要治疗手段仍是手术、放射治疗和化疗[8-9]，但治疗后病死率及并发症发生率较高，严重影响患者预后及生存质量。研究食管癌预后相关生物标志物对提高患者生存率和改善患者生存质量有重要意义。

miR-93属于miR-106b-25 miRNA簇，近年来有研究[10]发现，miR-93在多种消化道肿瘤组织或细胞中过表达，且与肿瘤的转移和治疗耐药性等密切相关。宋卫敏等[11]发现，miR-93在ESCC组织中的表达量较对应的癌旁组织明显升高，miR-93表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期相关。Fabbri等[12]发现，神经母细胞瘤细胞系中miR-93高表达，可通过靶向上调表皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)的表达，促进肿瘤血管生成。本研究结果中，与健康对照组相比，miR-93表达水平在食管癌患者血浆中高表达，结果与Ansari等[3]研究相似，且与食管癌患者TNM分期、分化程度和淋巴结转移密切相关，说明血浆miR-93水平变化可能与食管癌发生、发展有关，miR-93高表达可能具有促进食管癌组织生长的作用，也调控某种炎性因子以加重癌细胞所处炎症环境，从而加速食管癌发展进程。

由于miRNAs以稳定的形式存在于各种体液包括血液、尿液及粪便中，miR-144则在多种疾病中发生显著的变化，使其可以作为多种疾病特异、敏感的生物标志物，但目前miR-144的作用靶点及机制不明确[13]。Shao等[14]发现，相较癌旁正常细胞，ESCC细胞中miR-144表达降低，在ESCC细胞系中miR-144转染抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力更强。Xiao等[15]研究发现，miR-144过表达可促进肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭，增强肾透明细胞癌恶性程度和对化疗药物耐药性。有动物研究[16]发现，反流性食管炎大鼠食管黏膜miR-144表达水平升高，氧化应激、黏膜屏障相关指标表达显著升高。本研究中miR-144表达在食管癌患者血浆中呈高表达，与Sharma等[17]研究显示miR-144在食管癌患者血清样本中显著上调结果相一致；且与食管癌患者TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关，提示miR-144可能参与食管癌进展，miR-144高表达或与食管癌黏膜屏障受损、食管癌所导致的炎症应激有关。miR-93和miR-144均可能参与促进肿瘤进展的某种机制，但尚不清楚是否存在共同的通路或靶标，仍需进一步研究。

Kaplan-Meier生存曲线显示，食管癌患者miR-93、miR-144低表达组6个月生存率均高于高表达组，提示miR-93、miR-144高表达可能是影响食管癌患者死亡发生的危险因素。COX多因素分析显示，miR-93高表达、miR-144高表达、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期是预测食管癌患者术后生存期的独立危险因素，提示在食管癌发生过程中miR-93、miR-144高表达可能预示食管癌患者术后生存期短等不良预后发生。

综上所述，miR-93、miR-144在食管癌患者血浆中呈高表达，与患者TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关，是影响食管癌患者不良预后发生的独立危险因素。但本研究仍存在一些不足，如样本量过小，未来可通过扩大研究对象群体或延长研究时间来解决这一问题；miR-93、miR-144是否存在共同靶标或机制，亟待进一步研究。