抗菌肽LL-37通过激活AMPK介导的自噬对结肠癌HT-29细胞凋亡的研究

谢亚锋，许志杰，丁雅婷，闫圣玉，张 侨，刘菀莹，刘丽兵

结肠癌是最常见的消化道肿瘤之一，在全球癌症相关死亡率中排行第三[1]。由于结肠癌具有局部复发、远处转移以及化疗耐药的特性，是一种高死亡率的疾病[2]。寻找更多的潜在治疗性生物靶标是治疗结肠癌的理想思路。AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是能量代谢调节关键因子，参与调控介导自噬的过程[3]。自噬通过消化功能失调的蛋白质和细胞器，在致癌作用中起重要作用[4]。抗菌肽LL-37是人体内发现的一种组织蛋白酶类抗菌肽，由前体肽hCAP-18水解释放[5]。研究[6-9]表明，LL-37在胃癌、肺癌、黑色素瘤及白血病中异常表达。作为肿瘤抑制因子，hCAP18/LL-37在胃腺癌和淋巴细胞白血病中表达下调。然而，AMPK和自噬是否参与了抗菌肽LL-37对结肠癌细胞凋亡的调控尚不明确。该研究探讨了抗菌肽LL-37对结肠癌HT-29细胞凋亡的作用机制，为明确相关作用机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂人结肠癌细胞株HT-29购自北京北纳生物(BNCC)细胞库。McCOY's 5A培养基购自美国SIGMA公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司；AMPK抑制剂购自德国Merck公司；抗菌肽LL-37购自上海锐东生物科技有限公司；Annexin-V FITC/PI双染试剂盒购自上海贝博生物公司；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo公司；兔抗Bax(1 ∶1 000)、兔抗Bcl-2(1 ∶2 000)、兔抗p-AMPK(1 ∶1 000)、兔抗LC3A(1 ∶50 000)、兔抗LC3B(1 ∶1 000)、兔抗GAPDH(1 ∶2 500)、兔抗AMPK(1 ∶1 000)、兔抗Beclin1(1 ∶2 000)、兔抗Atg5(1 ∶1 000)、二抗山羊抗兔IgG(1 ∶2 000)均购自英国ABCAM公司。

1.2 实验仪器超净工作台购自苏州智净净化设备有限公司； CO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司；倒置荧光显微镜购自德国莱卡公司；流式细胞仪购自美国Beckman公司；电泳仪和全自动化学发光分析仪购自上海天能科技有限公司。

1.3 细胞培养及分组处理使用含有10%FBS的McCOY’s 5A 培养基，在37 ℃、5%CO2的培养箱内培养HT-29细胞。将细胞分为对照组、低浓度组(50 μg/ml)、中浓度组(100 μg/ml)和高浓度组(200 μg/ml)，检测不同浓度抗菌肽LL-37处理48 h对HT-29细胞凋亡，AMPK活性以及自噬的影响。此外，将细胞分为高浓度组(200 μg/ml)和高浓度LL-37联合 AMPK抑制剂组，先采用AMPK抑制剂(10 μmol/L)预处理30 min后，再采用高浓度200 μg/ml抗菌肽LL-37处理48 h，检测AMPK被抑制后，抗菌肽LL-37对HT-29细胞凋亡和自噬的作用。

1.4 Annexin-V FITC/PI双染法检测HT-29细胞凋亡取对数期细胞，以2×105个/ml细胞浓度接种于6孔板中，分组处理后在细胞培养箱中培养48 h，收集细胞并将细胞浓度调整为4×105个/ml，用PBS洗涤细胞2次后，用500 μl PBS溶液将细胞重悬。每孔分别加入5 μl Annexin-FITC和5 μl PI，充分混匀后室温避光30 min。完成孵育后立刻上流式细胞仪进行细胞凋亡定量检测。

1.5 Western blot检测HT-29细胞凋亡、AMPK以及自噬相关蛋白表达分组处理48 h后收集细胞，加入RIPA裂解液后，提取细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度后，用10 %的SDS-PAGE胶分离蛋白，用湿转法转膜至PVDF膜。用5 %脱脂奶粉封闭后，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜。再将辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h后，加入ECL显色，曝光后采集图片。以GADPH为内参，用软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1 抗菌肽LL-37促进结肠癌HT-29细胞凋亡Annexin-V FITC/PI双染法检测结果(图1)显示，4组细胞进行比较，组间凋亡率差异有统计学意义(F=195.01，P<0.001)。与对照组比较，低浓度组细胞凋亡率没有改变，而中浓度和高浓度细胞凋亡率升高(t=12.79,P<0.001；t=22.14，P<0.01)。Western blot检测结果(图2)显示，4组细胞进行比较，凋亡率组间差异有统计学意义(F=45.53，P<0.001)；与对照组比较，低浓度组Bcl-2/ Bax没有变化，而中浓度和高浓度细胞Bcl-2/Bax降低(t=9.87，P<0.05；t=12.93，P<0.01)。结果表明一定浓度的抗菌肽LL-37能促进结肠癌HT-29细胞凋亡。

2.2 抗菌肽LL-37促进结肠癌HT-29细胞自噬Western blot实验结果(图3)显示，4组细胞进行比较，LC3II/LC3I(F=91.08，P<0.001)、Atg5(F=54.11，P<0.001)以及Beclin1(F=47.28，P<0.001)表达水平组间差异有统计学意义。与对照组比较，低浓度组细胞Beclin1、Atg5以及LC3II/LC3I没有变化，而中浓度和高浓度组细胞Beclin1(t=7.75，P<0.05；t=8.63，P<0.01)、Atg5(t=6.189，P<0.01；t=13.12，P<0.001)以及LC3II/LC3I提高(t=12.94，P<0.001；t=13.13，P<0.001)。结果说明一定浓度的抗菌肽LL-37能促进结肠癌HT-29细胞发生自噬。

图1 流式细胞术检测HT-29细胞凋亡

图2 Western blot法检测凋亡蛋白表达水平

图3 抗菌肽LL-37在HT-29细胞中对自噬相关蛋白表达的影响

2.3 抗菌肽LL-37促进AMPK信号异常激活Western blot实验结果(图4)显示，4组细胞进行比较，p-AMPK/AMPK(F=112.70，P<0.001)表达水平组间差异有统计学意义。与对照组比较，低浓度组细胞p-AMPK/AMPK无变化，而中浓度和高浓度组细胞p-AMPK/AMPK升高(t=6.76，P<0.01；t=15.76，P<0.01)。结果表明一定浓度的抗菌肽LL-37能激活AMPK信号。

图4 抗菌肽LL-37在HT-29细胞中对AMPK活化的影响

2.4 阻断AMPK信号抑制结肠癌HT-29细胞凋亡Annexin-V FITC/PI双染法检测结果(图5)显示，与高浓度组比较，高浓度+AMPK抑制剂组细胞凋亡率降低(t=7.70，P<0.01)。Western blot检测结果(图6)显示，与高浓度组比较，高浓度+AMPK抑制剂组Bcl-2/ Bax升高(t=7.74，P<0.05)。结果表明AMPK信号参与了抗菌肽LL-37促结肠癌HT-29细胞凋亡的作用。

图5 流式细胞术检测细胞凋亡率

图6 Western blot法检测凋亡蛋白表达水平

2.5 阻断AMPK信号抑制结肠癌HT-29细胞自噬Western blot实验结果(图7)显示，与高浓度组比较，高浓度+AMPK抑制组细胞Beclin1(t=12.28，P<0.01)、Atg5(t=7.00，P<0.01)以及LC3II/LC3I降低(t=6.03，P<0.01)。结果提示AMPK参与了抗菌肽LL-37促结肠癌HT-29细胞发生自噬的作用。

图7 阻断AMPK信号对抗菌肽LL-37处理的HT-29细胞自噬相关蛋白表达的影响

3 讨论

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有抗菌活性的先天免疫效应分子活性肽，主要由上皮细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞合成和释放。当出现内外源刺激时，前体肽原hCAP-18便会水解释放LL-37。由于N端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)，而总氨基酸残基总数为37，因此命名为LL-37[10]。有研究[11]提出，抗菌肽LL-37作为肿瘤抑制因子，在结肠癌中LL-37的表达下调，并且临床样本检测显示，LL-37与肿瘤细胞的凋亡紧密相关。结合LL-37在结肠癌中的表达下调和LL-37与结肠癌细胞凋亡紧密相关，可以猜想LL-37在结肠癌发生中是否具有促/抗凋亡功能。有数据[12]显示，在p53野生型结肠癌细胞中，LL-37诱导磷脂酰丝氨酸外显和DNA片段化而不激活半胱天冬酶，说明LL-37能诱导半胱天冬酶依赖性凋亡的发生。小鼠源性抗菌肽(mouse cathelin-related antimicrobial peptide，mCRAMP)灌肠研究[13]发现降低了氧化氮甲烷和硫酸葡聚糖诱导的结直肠癌癌小鼠的肿瘤大小和数量，但不诱导肿瘤和相邻正常结肠组织的细胞凋亡。本研究显示，抗菌肽LL-37能促进结肠癌细胞HT-29的凋亡，异常激活HT-29细胞自噬，并且LL-37对结肠癌细胞HT-29的作用呈浓度梯度趋势。

AMPK作为一种中枢代谢调节因子，是一种维持细胞能量平衡的代谢应激传感酶，已被广泛应用于能量消耗或补偿途径。葡萄糖/糖原代谢是一种主要的代谢途径，参与多种细胞活动，如增殖、生长和抗应激。葡萄糖饥饿是一种有效的生理性AMPK激活状态，在这种状态下，AMPK会根据细胞或组织触发各种代谢事件。自噬是一种重要的降解途径，它不仅能维持细胞内平衡，去除蛋白质聚集物和功能失调的亚细胞器等潜在的危险成分，而且还能对营养缺乏等代谢应激作出适应性反应。证据[14]表明，自噬与包括AMPK在内的营养信号模块密切相关，以根据许多不同的细胞信号对代谢途径进行微调，AMPK和自噬对代谢紊乱也有一定的作用。本研究显示，抑制AMPK活性，能抑制结肠癌细胞HT-29的凋亡和自噬发生。有研究[15]提出，抗菌肽LL-37参与了4-苯基丁酸盐(PBA)对人巨噬细胞结核分歧杆菌(MTB)的自噬诱导，并且呈依赖性。沉默LL-37，PBA不能诱导MTB感染的人巨噬细胞发生自噬，当重新补充LL-37后，PBA恢复诱导细胞内自噬功能[15]。本研究显示，抗菌肽LL-37能异常激活AMPK的活性，且呈浓度趋势。在抗菌肽LL-37处理后的结肠癌细胞HT-29中添加AMPK抑制剂后，抑制AMPK能抑制LL-37处理后的结肠癌细胞HT-29的凋亡，降低LL-37处理后的HT-29细胞的自噬。

综上所述，抗菌肽LL-37能促进结肠癌细胞HT-29的凋亡，并且该过程与激活AMPK介导细胞发生自噬相关。该结果为深入了解抗菌肽LL-37促进结肠癌细胞凋亡的相关分子机制提供了一部分实验依据，为后续的潜在靶向治疗提供了思路。