高通量法测定血小板自身抗体的含量及临床意义

赵贇霄，左 斌，阮长耿, 何 杨

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是一种以血小板减少为主要特征的出血性疾病。研究[1]表明，ITP患者体内可检测出针对多种血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)的自身抗体，主要包括抗GPⅡb/Ⅲa和Ⅰb/Ⅸ自身抗体[2-3]。自身抗体与血小板结合后通过其Fc段被肝脾网状系统巨噬细胞识别吞噬，从而使血小板减少。有研究[4]表明不同自身抗体介导的血小板减少机制可能存在差异。抗GPⅠb自身抗体可通过Fc受体非依赖性机制使血小板减少。 因此，单一自身抗体的检测已无法满足ITP疾病的诊断和评估，需要同时鉴定多种自身抗体的特异性类型，以指导后续治疗。流式免疫微球芯片技术(flow cytometricimmuno-bead array, FCIBA)以聚苯乙烯微球为载体，并用荧光加以区分同一体系中的不同微球，从而实现高通量检测。

1 材料与方法

1.1 病例资料

1.1.1ITP组 选择2016年11月15日—2017年11月10日在苏州大学附属第一医院就诊患者共661例，其中男性249例、女性412例，年龄15～86(48.12±15.32)岁，血小板计数为(5～96)×109/L。ITP诊断依据美国血液学协会指南[5]。另跟踪调查地塞米松治疗前后患者75例，口服地塞米松40 mg/d，服用4 d。

1.1.2非免疫性血小板减少组(Non-ITP) 选择同期在苏州大学附属第一医院血液科就诊患者87例，其中男性39例、女性48例，年龄13～61(48.81±16.32)岁，血小板计数为(20～99)×109/L。包括再生障碍性贫血31例、急性淋巴细胞白血病18例、淋巴瘤17例、骨髓异常增生综合征21例。

1.1.3正常对照组 选择同期在苏州大学附属第一医院体检者158例，其中男性89例、女性69例，年龄21～57(33.41±9.93)岁，血小板计数为(121～287)×109/L。

1.2 方法

1.2.1外周静脉血采集与处理 分别采集各组外周静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝；室温下1 000 r/min离心5 min，吸取上层富血小板血浆(platelet rich plasma, PRP)至1.5 ml离心管；3 000 r/min离心5 min，弃去上清液；血小板沉淀加入1 ml含0.05%EDTA的0.01 mmol/L PBS(pH7.6)，吹打混匀，3 000 r/min离心5 min，弃上清液。如此将血小板洗涤3次后，弃上清液后，-80 ℃冻存备用。

1.2.2FCIBA检测血小板特异性自身抗体 依据He et al[6]报道的方法。用鼠源性抗GPⅨ、抗GPⅠb、抗GPⅢa、抗GPⅡb和抗P-选择素的单克隆抗体SZ1、SZ2、SZ21、SZ22和 SZ51(本研究所制备)，分别包被于自身带有5种不同强度APC-cy7荧光的聚苯乙烯微球(美国Spherotech公司)。采用流式细胞仪分别检测ITP组、Non-ITP组和正常对照组GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa和P-选择素5种自身抗体，抗体水平以平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)表示。

1.2.3改良间单克隆抗体俘获血小板抗原技术(monoclonal antibody immobilization of platelet antigens, MAIPA)检测血小板特异性自身抗体 根据已报道的ELISA方法[7]分别检测ITP组、Non-ITP组和正常对照组GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa和P-选择素5种自身抗体。

1.3 统计学处理实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。样本间MFI比较采用独立样本t检验，地塞米松治疗前后抗体水平采用单因素方差分析。采用SPSS软件绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线并计算曲线下面积(area under the curve，AUC)以评估FCIBA所检测的血小板抗体水平对ITP的诊断效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微球稳定性测定于微球包被后的第1、5、10、20、60天测定微球的MFI值。SZ1、SZ2、SZ21、SZ22和SZ51 5种单克隆抗体的MFI。结果显示包被微球在包被后第60天依然保持稳定。

2.2 批内、批间精密度评价

2.2.1批内精密度 通过对同一份阳性血浆重复检测20次，5种单克隆抗体SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51的批内变异系数分别为8.35%、 5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。

2.2.2批间精密度 通过对同一份阳性血浆连续检测10 d，5种单克隆抗体SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51的批间变异系数分别为10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。

2.3 FCIBA方法学性能评价

2.3.1敏感度 FCIBA法分析ITP组661例样本，其中抗GPⅨ阳性率为71.0%，抗GPⅠb阳性率为82.1%，抗GPⅢa阳性率为71.7%，抗GPⅡb阳性率为71.0%，抗P-选择素阳性率为72.0%，5种抗体联合检测的阳性率为89.0%。FICBA和MAIPA敏感度差异无统计学意义。见表1。

2.3.2特异度 FCIBA法分析Non-ITP组和正常对照组245例样本，其中抗GPⅨ阴性率为80.4%，抗GPⅠb阴性率为80.8%，抗GPⅢa阴性率为79.2%，抗GPⅡb阴性率为76.7%，抗P-选择素阴性率为79.2%，5种抗体联合检测的阴性率为66.5%。FICBA和MAIPA特异度差异无统计学意义。见表1。

2.3.3精确度 FCIBA法分析总共906例样本(3组共906例)，其中抗GPⅨ准确度为73.5%，抗GPⅠb准确度为81.8%，抗GPⅢa准确度为73.7%，抗GPⅡb准确度为72.5%，抗P-选择素准确度为74.0%，5种抗体联合检测的准确度为82.9%。FICBA和MAIPA精确度差异无统计学意义。见表1。

2.3.4ITP组、Non-ITP组和正常对照组MFI 与Non-ITP组比较，ITP组抗GPⅨ(t=7.841，P<0.01)、抗GPⅠb(t=9.266，P<0.01)、抗GPⅢa(t=8.543，P<0.01)、抗GPⅡb(t=8.336，P<0.01)、抗 P-选择素(t=8.841，P<0.01)5种抗体的MFI均高于Non-ITP组，差异有统计学意义。与正常对照组比较，ITP组抗GPⅨ(t=8.282，P<0.01)、抗GPⅠb(t=12.195，P<0.01)、抗GPⅢa(t=10.414，P<0.01)、抗GPⅡb(t=9.933，P<0.01)、抗P-选择素(t=10.268，P<0.01)5种抗体的MFI均高于正常对照组，差异有统计学意义。与正常对照组比较，Non-ITP组5种抗体的MFI差异无统计学意义。见表2。

表1 FICBA和MAIPA敏感度、特异度和精确度的比较 [n(%)]

表2 ITP组、Non-ITP组和正常对照组

2.4 地塞米松治疗前后ITP患者自身抗体的变化75例ITP患者经过口服地塞米松治疗前后5种抗体的阳性率下降，治疗后较治疗前差异有统计学差异，抗GPⅨ(F=27.522，P<0.01)、抗GPⅠb(F=41.752，P<0.01)、抗GPⅢa(F=97.937，P<0.01)、抗GPⅡb(F=107.189，P<0.01)、抗P-选择素(F=67.380，P<0.01)。详见表3。

表3 地塞米松治疗前后5种抗体的变化[N=75,n(%)]

2.5 ROC曲线利用SPSS软件生成5种自身抗体的ROC曲线，见图1。采用约登指数计算Cut-off值及最佳灵敏度和特异度。SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51共5种单克隆抗体的Cut-off值分别为9.385、20.605、17.770、17.385、15.985，对应的AUC分别为0.827[95%CI:0.797～0.856](P<0.01)、0.904[95%CI:0.883～0.925](P<0.01)、0.843[95%CI:0.813～0.873](P<0.01)、0.835[95%CI:0.805～0.865](P<0.01)、0.841[95%CI:0.812～0.871](P<0.01)。

3 讨论

ITP是一种常见的出血性疾病，以血小板数量降低为主要表现，并且在ITP患者的外周血中经常可以检测到抗血小板抗原的自身抗体[8]。通过利用流式细胞术建立一个新的检测血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的方法。该方法的基本原理是将5种不同的单克隆抗体包被在5种直径为4 μm的聚苯乙烯微球上，而微球本身带有不同荧光强度的APC-cy7，在同一反应体系中能够被流式细胞仪区分，从而实现同一分标本可以同时检测5项指标。

图1 5种单克隆抗体诊断ITP的ROC曲线

在本研究中，FCIBA方法具有60 d的稳定性。并且该方法具有相对较小的批内、批间差异，SZ1、SZ2、SZ21、SZ22、SZ51 5种单克隆抗体的批内差异分别为8.35%、5.65%、3.41%、3.63%和3.51%。批间差异分别为10.10%、9.13%、8.04%、9.59%和10.20%。与He et al[6]报道的方法数据基本一致。

分别采用FCIBA和MAIPA方法对ITP患者样本中血小板自身抗体进行检测，显示FCIBA方法具有与MAIPA方法相当的敏感度，更高的特异度和准确度(表1)。临床样本检测显示ITP组相较于Non-ITP组和正常对照组差异均有统计学意义(P<0.01，表2)。同时跟踪调查了75例口服地塞米松ITP患者治疗前后5种自身抗体的变化情况。显示地塞米松治疗后自身抗体低于治疗前(P<0.01，表3)，结果与文献[9]报道一致。FCIBA法操作更简单，耗时更少，效率更高，对患者血小板的需求量更少，具有更强的临床适应性，同时也能对用药后起到监测疗效的作用。

根据ROC曲线所确定的Cut-off值，评估各自身抗体对ITP疾病的诊断效能。根据约登指数，FCIBA方法具有较高的敏感度、特异度。若联合检测5种自身抗体可大大提高检测准确度。

该研究表明流式免疫微球技术直接检测ITP患者血浆中的血小板自身抗体具有较高的敏感度、特异度和准确度，并且更高效便捷，能更好地适用于临床检测。