内蒙古通辽地区野生蘑菇“天合板”ITS初步鉴定*

庞 杰，康立茹，2，王葆生，于传宗**，王海燕，孙国琴，李亚娇

（1.内蒙古自治区农牧业科学院蔬菜研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010030）

随着我国社会经济生活的不断发展，人们对野生食用菌产品的需求越来越多。由于目前野生食用菌资源开发缺乏有效的管理和监督制约机制，主要以掠夺性采挖为主[1-2]；致使我国大量的优质野生食用菌资源分布越来越少，也严重的影响当地的生态环境[3]。经实地考察，通辽地区努鲁儿虎山脉有一种独有食用菌，俗称“天合板”，目前还无法人工培育，产量极少，干菇售价每千克已达到1 000元～1 200元。近年来随着市场需求量的增加，可以采集到的“天合板”食用菌越来越少，当地老百姓也难以采挖。

野生食用菌种质资源的收集与鉴定是开发利用的前提[4]。传统的野生食用菌资源鉴定主要是依靠外观形态鉴别[5]。但由于缺乏科学权威的评判标准，而且有些食用菌种类子实体形态差异较小，例如锡林郭勒草原上的野蘑菇（Agaricus arvensis）、大肥蘑菇（Agaricus bitorquis）、黄斑蘑菇 （Agaricus xanthoderma） 等，被统称为“黑蘑”，一般仅依赖形态特征的传统鉴定分辨不同较为困难[6]。随着分子生物学研究的不断深入，分子标记技术因其准确、快速、简便的特点，受到人们的重视。在分子标记中，转录间隔区序列 （internal transcribed spacer，ITS） 区域片断较小，易于分析，是中度保守的序列，其表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这些特征使ITS在真菌物种的分子鉴定及真菌的系统发育研究应用中最为广泛[7-8]。因此ITS可应用于真菌菌种鉴定、系统发育、条形码和群体多样性研究中[9]。以通辽地区采集到的“天合板”食用菌为试验材料，对其进行ITS鉴定，旨在探明“天合板”食用菌的分类学地位，为进一步开发和保护这种地区特色野生食用菌种质资源奠定基础。

表1 ITS序列于GenBank种比对结果Tab.1 Comparison results of ITS sequences on GenBank

1 试验材料

1.1 野生资源采集

2018年在内蒙古通辽市采集，由当地老乡依据形态特征鉴定为通辽地区“天合板”食用菌。

1.2 试验方法

DNA提取采用CTAB法[10]，PCR反应体系参照参考文献[11]。PCR 引物为 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 、 ITS4（ 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[12]，由上海生工合成；ITS测序由北京博迈德基因技术有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 ITS测序及NCBI数据库比对结果分析

ITS测序及NCBI数据库比对结果见表1。

由表1所示，测定的样品子实体rDNA ITS序列长度为681 bp，其中CG含量为42.58%，测序质量优良。将序列提交至NCBI数据库，获得序列号为MK335698，比对后共获得100个比对结果，其中同源性仅与 Leucopaxillus sp.（KY173356.1） 为 99%，最大评分（Max score） 为1 216；与其他物种同源性在86%～81%，最大评分647～501。

2.2 系统发育分析

从NCBI数据库中下载比对到的100个DNA序列结果，采用MEGA v7.0.14软件（邻接法，neighbor-joining methhod） 对DNA序列结果进行系统发育树的构建及遗传距离的计算。系统发育树结果见图1。

由图1所示，天合板（THB） 与其他40个食用菌亲缘关系较近，其中与Leucopaxillus sp.（KY173356） 遗传关系最近，通过遗传距离判定确定为同一物种亲缘关系。进一步对系统发育树中于其系统发育关系较近的40个食用菌进行分析，信息统计结果见表2。

表2 与“天合板”有较近的亲缘关系的食用菌Tab.2 Edible fungi closely related to the THB

（续表 2）

由表2所示，亲缘关系接近的40个食用菌按照拉丁名可以分为12种。这12种食用菌分属3科，分别是口蘑科（Tricholomataceae）、鸡油菌科（Cantharellaceae） 和假杯伞科 （Pseudoclitocybaceae），其中口蘑科8种，假杯伞科3种，鸡油菌科1种。按照属分类可以分为7个属，其中口蘑科的4个属，分别是梭孢伞属[16]Atractosporocybe、假杯伞属[18-19]Pseudoclitocybe、Musumecia[17]和蜡蘑属 Laccaria；假杯伞科3个属，分别是Harmajaea[15]、杯桩菇属Clitopaxillus[13]和Musumecia[17]；鸡油菌科1个属为鸡油菌属 （Cibarius）。

3 结论与讨论

从NCBI数据库检索结果来看，天合板（THB）与KY173356.1（Leucopaxillus sp.）无论是从同源性还是从系统发育树都可以判定为同一种食用菌。然而以Leucopaxillus sp.为关键词在NCBI中检索，共计获得72个结果，其他命名为Leucopaxillus sp.的食用菌并未出现在“天合板”检索结果中，说明其与“天合板”并无亲缘关系，从而可以推断KY173356的命名可能并不准确，需要进一步研究分析。从NCBI数据库信息可知，KY173356采集于锡林郭勒盟多伦县，与通辽市地理位置较远，因此可以判定“天合板”并不是通辽地区独有种类。

通过系统发育树进一步分析，Cantharellula foetida（HQ533021.1） 单独1种划分为1类，进一步查询发现其属于鸡油菌科、鸡油菌属，通过分析NCBI数据库中其他鸡油菌属物种，判定HQ533021.1可能是口蘑科的某种食用菌，命名也有待进一步确定。因此可以判定“天合板”可能属于口蘑科或假杯伞科的食用菌。Alvarado等[17]研究结果表明，假杯伞科是为了适应多基因系统发育推论的结果而从口蘑科提出了一个新的类群分类，这也是Musumecia在分类中既出现在口蘑科，又出现在假杯伞科中的原因。通过检索可知口蘑科下分93属1 800余种[20]，绝大多数是美味可食的蘑菇，如松口蘑（Tricholoma matsutake）、鸡（Termitornyces albuminosus），还包括可大量栽培的香菇（Lentinus edodes）、侧耳（Pleurotus sp.）等。参考前人对口蘑科人工驯化研究成果，可以减小对“天合板”食用菌进行人工驯化的难度。

后续试验需要进一步对“天合板”食用菌子实体形态、菌丝体等形态学特征进行描述，并选择在真菌物种鉴定或者系统发育分析研宄中常用的方法鉴定，如核糖体DNA内转录间隔区（rDNA-ITS）、细胞核编码的核糖体大亚基DNA（nrDNA-LSU）、核糖体DNA基因间区（nrDNA-IGS）、延伸因子1α启动子 （EF1-α）、RNA聚合酶Ⅱ第二亚基（RPB2）、RNA聚合酶Ⅱ第一亚基（RPB1） 以及线粒体核糖体小亚基（mtSSU） 等[21]，从而明确“天合板”食用菌的分类学地位，为进一步开发和保护这一特色物种奠定基础。