甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4 x)的染色体核型分析

李 丽， 李 云， 张 璠， 潘 牧,3， 杨 航

(1.贵州省农业科学院生物技术研究所， 贵阳 550006； 2.贵州大学生命科学学院， 贵阳 550006；3.贵州农科特创农业科技开发有限公司， 贵阳 550006)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]是重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源用块根作物，广泛种植于100多个国家，在世界粮食生产中总产列第7位。我国甘薯年种植面积约660万hm2，占世界甘薯种植总面积的65.4%，年产量约1.5亿t，占世界甘薯总产的85.9%[1]。其原生种主要涉及野生近缘种Ipomoeatrifida的2 x、4 x和6 x多倍体复合体[2]。甘薯近缘野生种资源丰富，携带优良的抗性基因，在甘薯育种上发挥了极其重要的作用。由于甘薯染色体较小，数目较多，细胞质浓厚和染色能力弱，因而对其细胞学研究相对薄弱，滞后于水稻、小麦等其他作物[3]。国外对甘薯的染色体研究起步较早，薛启汗等[4]报道，甘薯近缘种I.tiliacea为二倍体 (2 n=2 x=30),I.trifida为六倍体(2 n=6 x=90),I.littoralis为四倍体(2 n=4 x=60)。与国际先进水平相比，我国甘薯的染色体核型研究工作起步较晚，现主要由中国农业科学院、徐州甘薯研究中心等单位开展工作，目前已取得较大进展。曹清河等[5]利用染色体压片法和花粉粒扫描电镜法对甘薯近缘野生种IpomoeahederaceaJacq.的体细胞染色体数目、核型及其分类地位进行分析和界定，明确了该甘薯近缘种的细胞遗传学信息及其在甘薯属中的进化程度。汤佳立等[3]利用荧光原位杂交技术分析栽培种甘薯(Ipomoeabatatascv.Xushu 18)染色体，发现徐薯18染色体上有8对或9对强弱不一的45 S rDNA信号，所有染色体的全长分布强烈而密集的杂交信号，着丝粒区、近着丝粒区和端粒区有增强的信号带。梁国鲁等[6]对甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida的二倍体(2 n=2 x=30)和六倍体(2 n=2 x=90)的核型进行了观察分析，探讨了该多倍体复合体的染色体结构变异与系统演化。而关于甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida(4 x)的染色体特征研究甚少，其核型信息也缺乏。因此，本研究采用常规染色体压片法对甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida(4 x) 的染色体数目进行计数和核型分析，为探讨甘薯多倍体的遗传学特征、系统演化及杂交亲本选配提供细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida(4 x)由国家甘薯产业体系贵阳综合试验站提供。

1.2 方 法

1.2.1染色体制片

试验材料均用甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida(4 x)组培苗萌发生根，用改良的去壁低渗法[7]制片。

预处理：待根长1～1.5 cm时，洗净置于吸水纸上，吸去水分后并将根尖放在浓度为0.002 mol·L-1羟基喹啉中，室温处理40～60 min，取出用蒸馏水漂洗3～5次。

前固定：用卡诺氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)对前低渗后的甘薯根尖进行固定2 h。

前低渗：将漂洗好的根尖材料放置蒸馏水中用蒸馏水作为前低渗液浸泡30 min，使染色体易于分散。

解离：将前低渗好的根尖材料放置于0.2 mol·L-1的盐酸溶液中在50～60 ℃温度下解离8～10 min。

后低渗：将解离好的根尖材料用蒸馏水漂洗3～5次用最后1次蒸馏水作为后底渗，低渗30 min。

染色：将低渗后的根尖置于干净载玻片上，加卡宝品红染液，染色15～30 min。

漂洗：将染色好根尖的材料用45%醋酸溶液漂洗8～10 min。

压片：将漂洗好的根尖(约0.2 cm)，置于盖玻片上，在显微镜下观察、拍照。

1.2.2染色体镜检方法

选取染色体完整、分散良好、着丝点清晰的中期分裂相进行染色体计数，在放大倍数为10×100倍镜下显微照相，并结合Adobe Photoshop CS软件进行调整,对图片进行排序、剪贴、制成核型图。

1.2.3核型分析

采用李懋学等[8]的方法进行核型分析，Image-pro plus软件对染色体的数目、臂长(包括长臂和短臂)进行测量，然后按Levan等[9]的方法计算相应的数据(包括相对长度、臂比值)。

表1 着丝点位置划分

2 结果与分析

2.1 甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4 x)的染色体数目

对100个近缘野生种Ipomoeatrifida细胞的染色体数目及形态进行分析，发现近缘野生种染色体为四倍体型。根尖组织细胞中存在染色体数有2 n=50、52、54、56、58，其中含有56条染色体的细胞数所占比例达到58%，根据生物体染色体数目统计原则，甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida的染色体数目为2 n=4 x=56。

表2 Ipomoea trifida的核型参数

2.2 甘薯近缘野生种Ipomoea trifida(4 x)的染色体特征

甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida的染色体数目为56条，可分为14组(A-N)，每组含有4条染色体(图1)。甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida的臂比范围为(1.20±0.36)～(3.64±0.36)之间，相对长度介于(23±6.93)～(26±5.96)之间。根据 Levan等[9]对着丝点的位划分标准，臂比大于2 的染色体所占比例为0.64，在0.51～0.99 之间，且最长臂/最短臂比值约为1.43，核型不对称系数为58.22%，其核型分类属3 A型。其核型公式为：2 n=4 x=56=6 m+4 sm+1 st+3 t。

注：a，b为甘薯近缘野生种Ipomoea trifida染色体原始图； c为甘薯近缘野生种Ipomoea trifida染色体配对图

3 讨 论

Ipomoeatrifida是一个复合种，包括二倍体、 四倍体、六倍体及其杂种，广泛分布于墨西哥-厄瓜多尔-巴西的热带美洲[6]。将甘薯品种之间进行任意杂交，能够分离出茎细、不结块根的野生类型, 从表型上很难将其分开, 因此可以通过现代生物技术、基因工程等方法将其区别。染色体核型分析是开展杂交育种、多倍体诱导和雌核发育等遗传育种工作的基础，对研究植物系统演化、物种之间的亲缘关系、起源、进化与分类，远缘杂交及遗传工程中的染色体鉴别具有重要意义[10]。甘薯近缘野生种被认为是开拓甘薯育种新的抗病、优质、抗逆等基因的重要来源之一，以近缘野生种作母本，综合性状较好的地方品种、新育成品系和外引品种资源作父本，让其杂交，已成为甘薯常规育种的手段之一。Ipomoeatrifida(4 x)种包含多个系统，推测有的Ipomoeatrifida(4 x)株系是Ipomoeatrifida(2 x)直接加倍产生的，有的是基因组重组与部分变异产生的，但表型均为野生型[11]。由于甘薯染色体的总体特征表现为小且多，本试验中，甘薯材料黔薯7号和黔薯6号因淀粉粒较多，染色难，不能确定其染色体数目和核型特征。本研究仅对甘薯近缘野生种Ipomoeatrifida(4 x)作了初步分析，要深入探讨甘薯的起源问题，还需结合分子生物学手段对不同类型、品种的甘薯进一步开展核型分析。