外源添加乙偶姻对酿酒酵母产2,3-丁二醇及其菌株的影响

张 弛，吕雨泽，邓利廷，孙 健，葛菁萍

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2微生物黑龙江省高校重点实验室/黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150080）

0 引言

2,3-丁二醇(2,3-BD)是一种应用化合物，被作为一种重要的化工原料，并且2,3-BD被航天、能源以及食品等多个领域广泛应用[1]。通常人们利用微生物以石油为底物的方式进行生产2,3-BD被广受欢迎，然而，现如今2,3-BD的生产含有不足之处：一是产量较低，二是2,3-BD的结构十分特殊，利用化学法合成2,3-BD的成本很高，所以不能用于工业化大规模生产[2]。近年来利用生物法来生产2,3-BD等产品受到人们的关注，同时在国内外其研究与发展速度飞快[3]，优势在于其成本低廉，工艺技术简单，同时具有降低污染，保护环境的作用[4-5]。

在大自然中，有许多常见的菌种可以用来生产2,3-BD，包括克雷伯氏菌属(Klebisellasp.)[6-7]、芽孢杆菌属(Bacillussp.)[8-9]以及酵母菌属(Saccharomycessp.)[10]等。不幸的是，克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属等被归类为II类致病微生物，容易造成具有危害性的工业生产[11-12]。相比之下，酿酒酵母已经被作为安全性较高的微生物，且具有2,3-BD生产能力[13-14]。这使得研究学者们将酿酒酵母作为生产2,3-BD的焦点。

但是，野生型酿酒酵母本身产生2,3-BD的能力有限，如果不加以人为干涉的话，还不具备进行大规模生产的潜力。因此人们从改造酿酒酵母代谢途径的角度出发，试图通过阻断其支路代谢途径[15]、过表达关键酶基因的方式[16]，来提高2,3-BD的产量。在酿酒酵母细胞中，2,3-BD的合成途径其一是通过丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase/PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在PDC催化下生成乙偶姻，最终乙偶姻在2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-butanediol dehydrogenase/BDH)作用下生成2,3-BD。所以，乙偶姻成为2,3-BD合成途径中重要的前体物质[17-18]。本课题组前期已经尝试对丙酮酸脱羧酶1和丙酮酸脱羧酶5基因进行了敲除，导致2,3-BD的产量明显提升。那么，外源添加适当浓度的物质乙偶姻后，是否会继续提高2,3-BD的产量以及菌株的生长？本研究将利用上述的两种突变株以及S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141原始菌株对此问题进行探究。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

1.1.1 试验菌株S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141，由黑龙江大学微生物重点实验室保藏。S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5，经过前期构建，其中W5-Δpdc1和W5-Δpdc5分别是敲除了丙酮酸脱羧酶1和丙酮酸脱羧酶5的基因工程菌株。

1.1.2 培养基 YPD液体培养基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，108°C高压灭菌20 min；葡萄糖单碳源发酵培养基(g/L)：葡萄糖80 g/L，YNB 3.4 g/L，蛋白胨 20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，(NH4)2SO410 g/L，pH自然，108°C高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1OD值与细胞干重二者关系确定 将培养至对数期的4株菌株，接种到培养基中培养12 h，30°C，140 r/min，在600 nm处吸光度下，测定吸光值。根据吸光值，进行梯度稀释，将菌液稀释成6个不同的浓度，进行离心后，弃上清，加入适量无菌水，在再行离心处理，将样品放入烘箱中烘干称重。

1.2.2 乙偶姻最适添加量的确定 将培养至对数期的S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141菌株，进行接种培养，外源添加0、2、4、6、8、10、12、14 g/L乙偶姻至培养基中培养84 h，30°C，140 r/min，每12 h取样，测定pH值、细胞干重(Dry Cell Weight，DCW)，利用高效液相色谱法(HPLC)对葡萄糖的消耗量、2,3-丁二醇产量以及乙偶姻剩余量进行检测，进一步确定添加乙偶姻的最适量。

2 结果与分析

2.1 外源添加乙偶姻方案的确立及候选菌株的确定

通过对S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141乙偶姻产量和BDH酶活进行检测（图1），发现S.cerevisiaeW5-Δpdc5的乙偶姻积累量和BDH酶活性均明星呈现先增加后降低的趋势，并且在发酵60 h时达到最大值，此时的乙偶姻积累量为0.626±0.04 g/L，BDH酶活性为0.0257±0.003 U/mg。然而，原始菌株S.cerevisiaeW5的乙偶姻产量为0.110±0.02 g/L，BDH酶活性为0.0099±0.001 U/mg，同时S.cerevisiaeW5-Δpdc5的乙偶姻产量是野生菌株S.cerevisiaeW141产量(0.282±0.02 g/L)的2.2倍，BDH酶活性两者一致。另外，研究发现S.cerevisiaeW5-Δpdc1的乙偶姻积累量呈现先上升后下降再上升的微弱趋势，在发酵24 h时积累量最大为0.129±0.01 g/L；BDH酶活性同样在24 h时达到最大值为0.0122±0.001 U/mg；同原始菌株S.cerevisiaeW5相比，乙偶姻积累量提高了17.3%，BDH酶活提高了23.2%，差异明显。然而，野生菌株S.cerevisiaeW141的乙偶姻产量和BDH酶活性均高于S.cerevisiaeW5-Δpdc1。综上所述，从乙偶姻产量和BDH酶活性随发酵时间变化的趋势可以看出，乙偶姻的量直接影响了BDH酶的活性，同时间接影响了2,3-BD的产量，最终研究确定外源添加乙偶姻的方案。

以上数据表明：第一，S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的2,3-BD产量较比原始菌株S.cerevisiaeW5的都有所提高，并且乙偶姻的积累量也会提高，同时促进了BDH酶的活性；第二，通过对S.cerevisiaeW141和S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的比较发现 ，S.cerevisiaeW141自身对乙偶姻的积累和BDH酶活性的作用，都是其作为2,3-BD出发菌株主要的优势。综上所述，针对于S.cerevisiaeW5/W141的优势和S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的不足之处，研究确定使用S.cerevisiaeW5/W141共同作为本实验生产2,3-BD的出发菌株。

图1 乙偶姻产量和BDH酶活检测结果

2.2 OD值与细胞干重关系曲线

利用OD600nm值来测定菌体生物量，按照1.2.1的方法。根据OD600nm值与DCW具体关系分别为公式(1)～(2)，结果证明，S.cerevisiaeW5/W141菌株OD600nm值和细胞干重成正比例关系。

2.3 乙偶姻最适添加量的确定

将菌株接种到发酵培养基中，外源添加0、2、4、6、8、10 g/L和0、2、4、6、8、10、12、14 g/L乙偶姻，30°C，140 r/min振荡培养72 h，每隔12 h取样，葡萄糖消耗情况（图2）、2,3-BD产量和乙偶姻剩余量随发酵时间的变化情况（图3）。

由图2可以看出，外源添加不同浓度的乙偶姻对S.cerevisiaeW141/W5，在代谢过程中，葡萄糖随着发酵时间的增加，而逐渐被消耗，则在24 h左右，葡萄糖均基本耗尽。

图2 S.cerevisiae W5/W141的葡萄糖消耗量随发酵时间变化的关系曲线

图3 S.cerevisiae W5/W141的乙偶姻剩余量和2,3-丁二醇产量随发酵时间变化的关系曲线

由图3可以看出，外源添加不同浓度的乙偶姻对S.cerevisiaeW5/W141来说，2,3-BD的产量随着乙偶姻添加量的增加而不断提高。对于S.cerevisiaeW141而言，当外源添加8 g/L乙偶姻时，2,3-BD的产量达到1.56±0.04 g/L(72 h)，乙偶姻在72 h时消耗完全；当外源添加10 g/L乙偶姻时，2,3-BD的产量达到2.17±0.01 g/L(72 h)，但乙偶姻并没有完全被消耗，72 h时积累了1.07±0.01 g/L。对于S.cerevisiaeW5而言，当外源添加12 g/L乙偶姻时，2,3-BD的产量达到2.49±0.02 g/L(72 h)；当外源添加14 g/L乙偶姻时，2,3-BD的产量达到2.75±0.03 g/L(72 h)，但乙偶姻仍然没有完全被消耗，72 h时积累了2.55±0.04 g/L。因此，从乙偶姻积累量上考虑，向S.cerevisiaeW5/W141分别添加12 g/L和8 g/L乙偶姻更适合作为后续试验的最适添加浓度。

2.4 乙偶姻对菌体活性的影响，通过菌体活性辅助说明代谢流向改变的菌体作用

2.4.1S.cerevisiaeW141外源添加8 g/L乙偶姻对的菌体活性的影响 运用细胞活性染色试剂PI对S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L菌体进行单染色。将不同时间段的荧光效果利用流式细胞仪对其检测，FCM图谱进行荧光差异比较（图4）。通过对横坐标（PI单染色）与纵坐标（侧向角散射）的对比来对菌体活性情况进行分析（图5）。

从图中可知，随着发酵时间的延长PI染色比例有所提高，并且所有数据都相对集中，S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L的变化趋势大致相同，均在60 h时达到最大分别为1.3%和1.9%，然而，对于流式细胞仪每次所收集的一万个细胞而言，整体细胞活性几乎没有受到影响。

2.4.2S.cerevisiaeW5外源添加12 g/L乙偶姻对的菌体活性的影响 运用细胞活性染色试剂PI对S.cerevisiaeW5/W5-12 g/L菌体进行单染色。将不同时间段的荧光效果利用流式细胞仪对其检测，FCM图谱进行荧光差异比较（图6）。通过对比从而分析菌体活性情况（图7）。

图4 不同时间段流式细胞术检测结果

图5 流式细胞术检测结果

从图中可知，随着发酵时间的延长PI染色比例呈现先上升后下降再上升的趋势，所有数据都不太集中，与S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L的变化趋势大致相同，均在24 h时达到最大分为0.6%和0.9%。

2.5 电镜观察菌体形态

将处理后的样品通过扫描电镜观察菌体外貌形态（图8）。可以看出，当S.cerevisiaeW141/W5在外源添加适量乙偶姻后，菌体表面圆滑平整，整体饱满，无明显变化。

3 结论与讨论

本研究前期通过尝试对丙酮酸脱羧酶的基因pdc1和pdc5进行敲除，在外源添加乙偶姻后，最终导致2,3-BD的产量不高。Yu等[19]敲除S.cerevisiae中的adh1、adh3和adh5基因后进行分批发酵，2,3-BD的产量达到2.29 g/L，与野生型S.cerevisiae相比，乙醇的产量降低31.25%，而2,3-BD的葡萄糖转化率显著提高，为0.113 g/g。但弊端是Δadh1、Δadh3、Δadh5会积累大量的毒性物质乙醛，且还会生成一定量的乙醇[20]。而前期试验结果2,3-BD的产量不高，可能是因为敲除了中心代谢的关键酶，所以，当2,3-BD代谢流增强时，菌株产能却减少了。因为在酿酒酵母中，乙醛和丙酮酸转化成乙偶姻过程中，丙酮酸脱羧酶在其中起关键作用，所以当丙酮酸脱羧酶基因被敲除后，导致关键酶的酶活降低，使乙醛和丙酮酸无法更多地转化成乙偶姻，最终导致菌株产2,3-BD的能力下降[21]。所以在2,3-BD合成过程中，关键酶起着至关重要的作用。

图6 不同时间段流式细胞术检测结果

图7 流式细胞术检测结果

通过酿酒酵母代谢路径可知，乙醇、甘油和2,3-BD的合成途径成为酵母菌代谢的三个主要支路[22]。因此，外源添加适当乙偶姻后促使2,3-BD产量增加的同时，必定减少了乙醇或甘油合成过程中的碳源分配，这可能是因为添加适当乙偶姻后，促进了关键基因的表达，从而使2,3-BD的产量有所提高，由于乙偶姻和2,3-BD之间的反应是可逆的[23]，所以当2,3-BD产量增加的同时也使丙酮酸到2,3-BD途径中相关酶的活性增加，所以，碳源在乙醇和甘油合成途径中减少的情况下，会导致最终的产量下降。同时，乙偶姻和2,3-BD的转化与NAD＋与NADH之间的转化具有偶联关系[24]。Ehsani等[25]提出了增加供氧的策略，在敲除ilv2基因并过表达als、aldc和bdh1基因的S.cerevisiae中增加溶氧量，甘油积累减少的同时，葡萄糖合成2,3-BD的理论产量比厌氧条件下高20%。这说明通过改变溶氧调节氧化还原平衡对于生产2,3-BD具有重要意义。Kawai S等[26]将2-丁酮作为外源添加电子受体，使NADH的含量降低，使甘油的产量下降，但2,3-BD的产量明显提高。Kim S等[27]发现NADH氧化酶可以将NADH氧化成NAD＋，为了降低NADH的浓度，在过表达als、aldc和bdh1的基因的S.cerevisiae过程菌株中外源表达乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中的NADH氧化酶，从而将甘油代谢流向2,3-BD，最终使2,3-BD的产量提高了23.8%。所以乙偶姻在被BDH催化生成2,3-BD的同时，也会受到NAD＋与NADH含量的影响[28]。

图8 电镜观察结果

本研究将S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141四株菌株进行试验对比，挑选出S.cerevisiaeW5/W141最适合作为出发菌株来生产2,3-BD，发现S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141外源添加乙偶姻的最适浓度为12 g/L和8 g/L，且当S.cerevisiaeW5最适添加量为12 g/L乙偶姻，且72 h时，2,3-BD的产量最大达到2.49±0.02 g/L，并且乙偶姻在发酵结束前消耗完全；S.cerevisiaeW141最适添加量为8 g/L乙偶姻，且72 h时，2,3-BD的产量最大达到1.56±0.04 g/L。当外源添加适量乙偶姻后，2,3-BD的产量之所以会提高，是因为在整个代谢过程中，乙偶姻与2,3-BD二者处于同一条代谢流中，且乙偶姻作为生产2,3-BD重要的前体物质，当乙偶姻的浓度升高时，同时也会伴随着最终产物的增加[29]。Brackman G等[30]利用异源过表达枯草芽孢杆菌的关键基因acoA和acoB，来增强乙醛转化为乙偶姻的能力，构建菌株进行分批补料发酵，最终2,3-BD的产量得到提升。Kim S等[31]在S.cerevisiae菌株的基础上，异源过表达B.subtilis中的alsS和alsD基因和内源bdh1基因后进行分批补料发酵，2,3-BD产量达到了29.1 g/L。理论上讲，在抑制乙醇代谢流向并过表达2,3-BD合成途径后，菌株可以利用葡萄糖经丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻合成2,3-BD，或经丙酮酸和乙醛转化成乙偶姻，最终合成2,3-BD。因此，说明在代谢过程中，前体物质的增加对产物的产量具有一定促进作用。所以，本研究还可以做进一步的优化。通过代谢过程手段使工程菌株具备利用廉价原料（木质纤维素和藻类）来合成2,3-BD，从而提高生产2,3-BD的能力，但是，该方法是否会影响菌株正常生长，这些都是今后需要去研究的。综上所述，本研究中选用S.cerevisiaeW5/W141作为出发菌株，通过外源添加适量乙偶姻，使2,3-BD产量得到了一定的提升，从而解决了单一酿酒酵母发酵2,3-BD产量低的问题，也为微生物高产2,3-BD开辟了新的空间。