5种紫金牛属植物种子形态及显微鉴别研究

符 丽，赵福瑞，郑希龙，李榕涛，顾雅坤，吴 怡，曾 琳

（1中国医学科学院药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，海口 570311；2海南医学院，海口 571199）

0 引言

紫金牛科紫金牛属(ArdisiaSwartz)是由Swtarz在1788年建立的植物分类[1]，本属植物多供药用，种子可榨油，主要生长在2400 m以下的疏、密林下或阴湿的灌木丛中，全球约300种[2]，中国有72种、12变种，主要分布在长江流域以南地区[3]。紫金牛属植物在民间一直有着丰富的药用价值，具有较强的杀菌、抑制肿瘤等活性[4]，因而备受国内外学者关注。如硃砂根所含皂苷对肿瘤、HIV等都有着治疗作用[5]；密鳞紫金牛在孕妇产后使用可增强体质。紫金牛属植物多为常绿灌木和地被植物，具有较高的观赏价值，经常被用于园林建设和室内装饰[6]中，如海南三亚名花公园就曾利用野生植株进行构建[7]。在紫金牛属植物其他研究方向中，有对化学成分进行研究，如梅玲等[8]对紫金牛属植物化学成分的研究现状进行了分析，对该属植物中化学成分的深入研究有较高参考价值；有对该属植物种群分布研究的，如王军等[9]对海南省各市县紫金牛属植物的分布进行聚类分析，确认海南省紫金牛属植物种类及分布；有对该属分支分类学关系进行研究的，如夏念和[10]基于形态学性状，运用分支分析方法对中国紫金牛属90个分类群的系统发育关系进行分析，为紫金牛属的分类修订提供依据；亦有对植物栽培技术及条件进行探索的，如邱迎君等[11]对4种紫金牛属植物种子的萌发条件进行了探索，为紫金牛属植物的栽培提供有力依据，但其栽培技术尚属稚嫩，未有进行大规模栽培。目前该属植物药用价值的开发依赖于野生资源，使得其数量急剧下降，想要合理利用其丰富的药用价值，必须有充足的种质资源作支撑，而对物种之间有明确的鉴别则对该属植物的种植和成分研究都有着重要意义。

种子从胚珠形成到果实脱落的整个发育过程是在植物的繁殖器官中进行的，其生长环境相对封闭，受到外界环境因素影响较小，因此种子的特征性状可作为植物科、属、种的鉴别依据[12-13]。在植物学上，种子是指由胚珠发育而成的繁殖器官，它的最外面是种皮，内含胚和胚乳[14]。而胚是一株植物生长发育的基础部分，形态各有不同，也可以单独作为植物种间鉴别的依据之一。一系列的相关研究不断地填充着紫金牛属植物的研究领域，该属植物研究领域虽然较为宽广，但尚未发现有对该属植物种间鉴别的研究。在紫金牛属植物探究中发现，硃砂根、矮紫金牛、铜盆花、东方紫金牛、密鳞紫金牛等植物种子在形态上相似度较高，该属植物种子之间大小形态差异不明显，种子普遍小且外观相似，易产生混淆，对种间鉴别易造成较大阻碍。解决种子之间的异同不仅对植物各领域研究方面有深远意义，对于物种间鉴别也起着重要作用。本研究主要使用体视显微镜和石蜡切片技术对紫金牛属植物的种子进行微形态观察和种子胚细胞排列探索，以期找出其中的差异。为紫金牛属植物物种鉴别提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2018年3—4月在中国医学科学院药用植物研究所海南分所实验室进行。

1.2 试验材料

供试材料（表1）为采自海南各地的紫金牛属植物（硃砂根、矮紫金牛、东方紫金牛、铜盆花、密鳞紫金牛）的种子，由国家南药基因资源库提供。试验试剂无水乙醇（纯度＞99.5%）、二甲苯、甲醛，分析纯，购自海南悦峰生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子外观性状观察 通过眼看、手摸、体式显微等方式对5种紫金牛属植物种子进行测量、观察，主要观察比较种子的形状、颜色、大小、表面纹理和质地[15]。

表1 5种紫金牛属植物种子采集地

1.3.2 种子微性状观察 周建理等[16]曾对210种常用的中药材进行初步观察记录，确定了微性状鉴定方法的可行性[17]。体视显微镜主要观察的是物体表面的反射光线所生成的影像特征，能够很好地观察比较种子的表面起伏、纹理等。比如微性状鉴定法在观察表皮细胞时虽无法看清细胞内的后含物，但对其表面的起伏、纹理和颜色则比生物显微镜看得更加清楚[18]。因此，本实验主要采用周建理提出的方法，运用体视显微镜(Nikon SMZ745T)对硃砂根、矮紫金牛、东方紫金牛、铜盆花、密鳞紫金牛种子的表面胚乳、切面等进行观察，连接电脑进行拍照记录，总结5种紫金牛属植物种子在微性状上的差异。

1.3.3 石蜡切片显微观察 不同紫金牛属植物种子由于其软硬程度不同，所需的石蜡切片条件也有所不同[19]，本试验主要在潘叶等[20]的基础上进行方法优化，切片方向为纵切，对影响因素固定的方法（常规法、微波固定法）、脱水时间、切片厚度、脱蜡时间等进行探索，得出每种种子石蜡切片的最佳实验方案。具体操作如下：

（1）固定：FAA固定液（70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL，福尔马林5 mL）对材料进行浸泡，微波固定，10 min换一次固定液，固定10～15次。

（2）脱水与硬化：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇、无水乙醇各2 h。

（3）浸蜡埋蜡：硬脂酸:石蜡(1:20)65℃ 2 h，换新的硬脂酸:石蜡(1:20)67℃2 h，将熔好的硬脂酸:石蜡(1:20)倒入纸盒，依次做好标记，冷凝后，修整成正方形或长方形小蜡块待用。

（4）切片：利用切片机（半自动轮转式切片机feica/Rm2245）进行切片，HI1210摊片机、HI1220烤片机制片。（温度均为40℃）。

（5）脱蜡：二甲苯、二甲苯、无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇各5 min。

（6）染色：1%番红溶液37℃ 2.5 h、70%乙醇、85%乙醇各5 min、0.5%固绿溶液6 s后换至95%乙醇。

（7）脱水透明：无水乙醇30 s、无水乙醇1 min、二甲苯30 s、二甲苯15 min。

（8）胶封：晾干后，在材料上滴1滴加拿大树胶，盖上盖玻片，轻敲将气泡压出，待胶干后除去多余树胶清洁好，制成永久切片。

其中，硃砂根、矮紫金牛种子因材质较软，上述方案为其最佳方案。东方紫金牛、铜盆花种子的浸蜡时间调整为每次4 h。密鳞紫金牛种子浸蜡时间为每次4 h，脱蜡步骤中每种试剂浸泡时间调整为每次10 min。

2 结果与分析

2.1 外观性状鉴别结果

由图1可见，5种紫金牛属植物种子均呈球形，基部内凹，直径4～8 mm，东方紫金牛和铜盆花种子比其他3种略小。5种紫金牛属植物种子均没有特殊气味，没有显色反应。东方紫金牛种子外种皮呈棕褐色、表面有纵向纹络凸起（见图1-A）；铜盆花种子外种皮呈棕色、表面有纵向纹络凸起（见图1-B）；硃砂根种子外种皮呈浅棕色、表面光滑有纵条纹（见图1-C）；矮紫金牛种子外种皮呈浅棕色、表面有密集纵向纹络凸起（见图1-D）；密鳞紫金牛种子外种皮呈红棕色、表面有纵向条纹络微凸、密集（见图1-E）。5种紫金牛属植物种子中，内种皮都呈红棕色，密鳞紫金牛种子质地最硬，硃砂根种子较软。

图1 5种紫金牛属植物种子外观体视图

2.2 微性状鉴别结果

2.2.1 种子胚乳表面鉴别结果 东方紫金牛种子胚乳表面光滑有金黄色粉末、粉末量较矮紫金牛种子多；硃砂根种子胚乳表面光滑、无镶嵌物，易剥开。铜盆花和矮紫金牛种子表面凹凸明显，而矮紫金牛种子凹陷处有金黄色粉末镶嵌，铜盆花种子无镶嵌物。密鳞紫金牛种子胚乳表面有蜡样光泽，颜色较其它种子深，有深棕色条纹，易区分。

2.2.2 种子切面鉴别结果 矮紫金牛和硃砂根种子切面相似度高，呈透明蜡样光泽，矮紫金牛种子胚为白色圆柱状，直立型，贯穿整个种子，而硃砂根种子胚是透明黄色圆柱状，较短。东方紫金牛和密鳞紫金牛种子切面呈白色，而铜盆花种子切面呈棕褐色蜡样光泽。东方紫金牛种子胚为白色圆柱状，直立型，胚乳外周有块状金黄色粉末，数量比矮紫金牛种子多，密鳞紫金牛种子胚乳有棕色沟壑镶嵌。

图2 5种紫金牛属植物种子胚乳表面体视图

图3 5种紫金牛属植物种子切面体视图

2.3 石蜡切片显微鉴别结果

硃砂根种子胚细胞形状多为方形，中部有纺锤形细胞，可观察出为环状纵向排列，排列较为混乱（见图4-A）。东方紫金牛种子胚比其他几种植物种子胚长且细，基本上呈不规则形状，排列紧凑，其中纺锤形细胞呈长条形纵向排列（见图4-C）。铜盆花种子胚细胞均由长方形构成，外层细胞与矮紫金牛相似，但比矮紫金牛的宽且短，中间细胞细长，呈纺锤形纵向排列，铜盆花种子胚的细胞排列是5种植物中最为整齐的（见图4-D）。密鳞紫金牛种子胚细胞整体呈细长形，个体形状不一，结构较为紧密，排列杂乱，细胞重叠较明显，未发现有纺锤形细胞（见图4-E）。5种紫金牛属植物种子胚细胞排列由齐到乱为铜盆花种子、矮紫金牛种子、东方紫金牛种子、硃砂根种子、密鳞紫金牛种子。

3 结论与讨论

由于设备光源有限，导致图片明亮程度稍有不同，但不影响实验结果分析。5种种子基部均有凹槽，其中密鳞紫金牛种子凹槽不明显。石蜡切片实验中，切片太厚，容易发生细胞重叠[21]，尤其是密鳞紫金牛种子的胚，细胞较小，排列紧密，普通切片厚度不能满足结果需要，本实验采用6 μm。换试剂过程中，要避免材料与空气接触太久，否则易产生材料脱落或脱色。固绿染色时，密鳞紫金牛种子胚部分比其他种子胚部分易上色。胶封时，材料会随着与树胶的接触而湿润，尽快赶走气泡固定盖玻片，否则易发生材料位移。在石蜡切片显微鉴别实验中，由于紫金牛属植物种子软硬程度不同，所需的石蜡切片条件也有所不同，在前人的基础上进行方法优化，对东方紫金牛、铜盆花种子的浸蜡时间，密鳞紫金牛种子脱水时间等过程均进行相应调整，得出种子石蜡切片的最佳实验方案，能对以后相关实验提供参考。显微鉴别部分只进行了石蜡切片的研究，如果能增加粉末鉴定方面的研究，相信会得到令人满意的效果。在研究中发现，5种紫金牛属植物种子胚位置长度略有不同，可从以上特征寻找改善种子萌发特性的方法。

种子微性状研究主要是借助低倍仪器对材料进行观察，在这层面上种子微形态的特征得以展示，不会破坏种子结构，可用在种子的鉴别与利用中[22]。紫金牛属植物种子的性状和显微鉴别的研究，对其物种鉴别有实际应用价值，且对植物分类学研究、生态适应性研究，以及药用价值的研究与应用都有重要的意义。5种紫金牛属植物种子在外观上较为相似，但在种子表皮纹饰[23]、胚细胞排列上有显著差异。

本研究对5种紫金牛属植物种子的外观性状等进行观察，体式显微镜下观察可见5种紫金牛属植物种子均呈球形，直径4～8 mm，东方紫金牛和铜盆花种子明显比其他3种种子略小；东方紫金牛和硃砂根种子胚乳表面光滑，但是东方紫金牛种子胚乳表面有金黄色粉末，而硃砂根种子胚乳表面无镶嵌物；铜盆花和矮紫金牛种子胚乳表面凹凸明显，铜盆花种子胚乳表面无镶嵌物，矮紫金牛种子胚乳表面有金黄色粉末镶嵌；密鳞紫金牛种子胚乳表面颜色较深，有深棕色条纹，易区别。矮紫金牛和硃砂根种子切面相似，呈透明蜡样光泽；东方紫金牛和密鳞紫金牛种子切面呈白色。5种紫金牛属植物种子质地由硬到软排列为密鳞紫金牛种子、东方紫金牛种子、铜盆花种子、矮紫金牛种子、硃砂根种子。密鳞紫金牛、东方紫金牛、铜盆花和矮紫金牛种子表面有纵向纹路凸起，其中密鳞紫金牛和矮紫金牛种子纹路较为密集，硃砂根种子表面光滑有条纹，种皮呈浅棕色。因此，上述差异可作为5种紫金牛属植物种子鉴别特征，有效避免了种子之间的混淆，对该属植物的种植和成分研究都有着重要意义。

致谢：中国医学科学院药用植物研究所海南分所的李伟杰在种子采集和实验过程中给予帮助，特此谢意！