口腔微生物菌群分布与儿童龋病的关系研究

马 双,李金义,刘朝基,兰福升,赵彩霞,吕 婕,杨志伟

人口腔中菌群数量有700多种，其中链球菌群、韦荣氏菌群、奈瑟氏菌群是口腔中最常见的菌群，正常菌群过度繁殖会导致龋齿的发生和进展[1-2]。口腔内温度、湿度适宜，营养来源丰富，为菌斑内细菌生长繁殖提供必要条件，也形成了动态平衡菌斑微生态系统[3]，当这种微生态系统平衡被打破，有致龋能力的产酸耐酸菌等增多，随之菌斑出现即产生龋病[4]。因此，研究致龋菌与龋病发生发展的关系对预防龋病的发生有重要意义[5]。而致龋菌与儿童龋病发生发展的关系鲜有报道，本文旨在探讨口腔微生物菌群分布对儿童龋病的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取本院2018年5月-2020年5月有龋(dmfs>6)患儿为患龋组，同期无龋(dmfs=0)患儿为对照组，每组30例。患龋组患儿男16例，女14例，年龄3～12岁，平均年龄(7.2±2.3)岁；对照组患儿男15例，女15例，年龄2～12岁，平均年龄(6.9±2.1)岁。2组患者基础资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本采集：指导患儿用清水漱口，采集区域用无菌生理盐水冲洗，棉卷作隔湿处理后刮取牙菌斑，对照组刮取正常牙面牙菌斑，患龋组刮取龋齿牙面牙菌斑，置放于100 μl TE缓冲液离心管中，经冰浴后转运至实验室，-20 ℃环境储存。

1.2.2 菌斑DNA提取：样本离心3 min后弃上清液，参照DNA提取试剂盒(Invitrogen公司)说明书方法提取。

1.2.3 16S rDNA PCR扩增(V3～V5)参照该片区引物序列：341f:5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’；907r：5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’，培养大肠杆菌相应的PCR产物。PCR程序流程：95 ℃ 5 min预变形，30循环；95 ℃ 30 s变性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s伸延，72 ℃ 10 min伸延。

1.2.4 DGGE分析：取用5 μl PCR产物经冰乙醇2.5倍体积压缩沉淀，使用20 μl无菌水进行溶解。运用Bio-Rad公司生产的D-code System电泳仪行DGGE电泳分离。选用变性梯度25%～40%，浓度8%的变性梯度凝胶，1×TAE电泳缓冲液，在220 V预电泳30 min，随后150 V持续电泳8 h，而后于溴乙锭染液染色15 min，凝胶成像仪拍照。

1.2.5 克隆测序及分析：挑选 DGGE 特异条带，行PCR扩增，扩增产物连接T1载体，转化后由感受态细胞进入，置于LB培养液培养。将培养菌液涂于IPTG及X-gal平板种培养，蓝白斑筛选，分别挑选10个/每平板于LB培养液(含氨苄青霉素)接种，经37 ℃作24 h培养，挑选50个阳性克隆菌液送中美泰和生物技术有限公司测序。

1.2.6 菌群检出率及细菌形态学鉴定：取用20 μl 10-1、10-2、10-3样本稀释液，于ROGOSA及MSBA培养平板进行接种，控制N2为80%、H2为10%、CO2为10%，经37 ℃作48 h培养。经肉眼可察MSBA平板典型变性链球菌菌落呈粗糙型、质硬及高凸，边缘崎岖，表层为磨玻璃样。经革兰氏染色并用油镜查看其菌落为G+小球菌，呈链状分散排列；Rogosa培养基上乳酸杆菌菌落呈白色，表面平滑，质地软、有突起，经革兰氏染色并用显微镜见乳酸杆菌为G+杆菌，呈长、短或棒状，可单个、成对或成串排列。

1.3 纳入标准及排除标准:纳入标准，即：①符合美国儿童牙科学会颁布的《2014 AAPD婴幼儿、儿童及青少年龋齿风险评估管理指南》中龋病诊断标准[6]并经由本院确诊患儿；②年龄2～12岁；③经医院伦理委员会审议通过，患儿家属知悉同意。排除标准：①近3个月内有抗生素服用史；②全身系统性疾病；③牙周疾病患儿。

2 结果

2.1 2组细菌菌门、菌属占比：60例研究对象牙菌斑中共检出细菌菌门类5个，属类28个，种系型88个，见表1。2组门类、属类差异无统计学意义(P>0.05)，2组门类占比及菌属检出率差异有统计学意义(P<0.05)；对照组种系型67个，较对照组种系型的75个更低(P<0.05)，见表2。

表1 2组患儿菌门检出率比较[n(%)]

表2 2组患儿菌属检出率比较[n(%)]

2.2 2组细菌基因型数目比较：患龋组经Real-Time PCR技术检测，优势菌属中轻链球菌、血链球菌及口腔链球菌基因型数目均低于对照组(P<0.05)，变异链球菌及远缘链球菌基因型数目与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，患龋组口腔牙菌斑总基因型数目低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 2组患儿牙菌斑基因型数目比较(个，

2.3 2组四种致龋菌检出率比较：经Real-Time PCR技术检测，患龋组远缘链球菌、变异链球菌、内氏放线菌及黏性放线菌比例均显著高于对照组(P<0.05)，见表4。

表4 2组四种致龋菌检出率比较

3 讨论

牙菌斑生物膜中的微生物在龋病病因学中有着重要地位，但导致龋病发生和发展的机制尚不明确。口腔内正常菌群因微生态环境改变而致菌群失调，是龋病发生的病因之一。本研究结果表明，60例研究对象牙菌斑中共检出门类5个，属类28个及种系型88个。患龋组拟杆菌门、梭杆菌门占比高于对照组；放线菌门、变形菌门、后壁菌属占比则低于对照组(P<0.05)，患龋者的菌门种类较无龋者稍有减少。在菌属水平上，菌属检出率可见龋病组普氏菌属检出率是对照组的一倍，而对照组链球菌和韦荣菌属检出率略高于龋病组。二氧化碳嗜纤维菌属及放线菌属检查率基本持平，这与王少果等发现Firmicutes和SR1菌门，Rothia、Alistipes和Catonella菌属的存在与龋病呈负相关，Scardovia等菌属的存在与龋病呈正相关的结论一致[7]。这可能与随着龋齿发展，口腔牙菌斑环境进一步发生变化，口腔整体环境pH值下降，二氧化碳嗜纤维菌属等产酸、耐酸菌等成为优势菌属，可适应环境变化的细菌继续繁衍生存，无法适应的细菌则相应减少有关。

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)在细菌检验领域已应用多年，其检测高效、准确[8]。本研究应用Real-Time PCR检测到患者口腔菌群的改变，患龋组口腔牙菌斑总基因型数目少于对照组(P<0.05)，表明龋病患者菌群多样性是受损减少的。患龋组牙菌斑中轻链球菌、血链球菌及口腔链球菌扩增的基因型数目较对照组明显减少(P<0.05)，但变异链球菌及远缘链球菌基因型数目与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明患龋组牙菌斑中轻链球菌、血链球菌及口腔链球菌口内正常菌群明显减少，但变异链球菌及远缘链球菌菌群相仿。此外，患龋组远缘链球菌、变异链球菌、内氏放线菌及黏性放线菌比例均显著高于对照组(P<0.05)，这可能与本研究对象为患龋儿童和健康儿童、重度低龄儿童龋患非常严重、口腔内均有大量已形成的龋洞有关。故在唾液中也含有大量龋洞中的变异链球菌和远缘链球菌，因此，菌斑中二者检出率高于对照组。此结果与文献报告结果一致[9-10]。研究表明远缘链球菌数量水平虽不如变异链球菌，但致龋潜能高于变异链球菌，耐酸、产酸能力均增强，在光滑面龋病起到关键作用[11]，在本研究2组四种致龋菌检出率比较中也得到了验证。而对放线菌属中的内氏放线菌及黏性放线菌数量水平分析中，患龋组内氏放线菌及黏性放线菌数量较对照组显著增高。其在龋齿菌斑呈酸化过程中，作为获得性薄膜形成后的先锋菌，促进了牙齿表面的黏附作用，使细胞凝集能力增强。其数量水平可对患儿龋病严重程度作初步判别，在菌斑形成及龋病发生机理的了解上具有重要作用。上述关键致病菌的检出是龋病儿童患龋情况的重要依据。

综上所述，与健康儿童相比龋病患儿口腔微生物菌群多样性减少，其中4种致龋菌远缘链球菌、变异链球菌、内氏放线菌和黏性放线比例升高，明晰了龋病的主要致病菌种类，为预防儿童龋病提供了一定的理论依据。