王鹏达,李 贞,李西梅,张 淼,马 宁,郝 倩,呼圣娟,刘建芳,白飞虎
目前结肠癌的发病率及死亡率居高不下,2012年我国新发结肠癌病例约33.13万人,死亡人数约为15.93万人[1]。早期结肠癌预后良好,中晚期肿瘤死亡率高,这就要求更加重视临床上的早期诊断、早期治疗。近期有研究发现膜联蛋白A7(ANXA7)对结肠癌细胞的增殖、分化和凋亡具有调节作用,但国内对于其在消化道肿瘤中的研究主要集中在胃癌方面[2]。本研究通过检测ANXA7在结肠癌、结肠腺瘤性息肉患者以及正常人群中肠黏膜组织及外周血中的表达情况,旨在明确ANXA7的表达与结肠癌临床病理特征的关系,以明确ANXA7是否有望成为结肠癌高危人群筛查的一项肿瘤标记物。
1.1 一般资料:收集2019年1月-2020年1月新入住我院确诊为结肠癌的患者70例作为结肠癌组,其中男37例,女33例,年龄(59±4.8)岁。选择结肠腺瘤性息肉患者70例,其中男性35例,女性35例,年龄(58±3.6)岁。选择健康体检者70例作为对照组(正常肠黏膜组),其中男性 37例,女性33例,年龄(59±3.3)岁。3组资料进行比较,差异无统计学意义(P>0.05),资料具有可比性。
1.2 纳入及排除标准:结肠癌组纳入标准,即采用结肠镜下活检或手术切除的术后组织标本经病理证实为结肠癌,无其它部位原发肿瘤。结肠癌分期采用《恶性肿瘤TNM分期标准(第七版)》[3]。结肠癌组患者采血前未进行放疗、化疗及生物学治疗,3组均排除患严重的内科疾病。健康体检组为肠镜检查正常的志愿者,并已签署伦理委员会通过的知情同意书。
1.3 试剂及设备:本研究中主要试剂ANXA7兔抗人单克隆抗体、ELISA试剂盒以及PBS液、抗原修复液、苏木素、DAB液均购自博奥森公司。
1.4 方法
1.4.1 采用免疫组化SP法检测组织中ANXA7表达:分别取手术切除或肠镜下活检组织的结肠癌组织,结肠镜检查的腺瘤性息肉及正常肠黏膜组织,4%甲醛液固定标本,使用石蜡包埋后制作切片。HE染色后显微镜下再次确认诊断,之后3组均按照免疫组化法说明书操作。稀释ANXA7兔抗人单克隆抗体工作浓度为1∶200,DAB显色后高倍显微镜下判读结果。判读标准以着色程度和着色细胞百分比进行综合评估。随机选择400倍视野下5个视野观察并计数,取其平均值,着色程度计分标准为:与阴性对照对比,无着色计为0分;淡黄色,较阴性对照着色深,计为1分,棕黄色计为2分;棕褐色,着色同阳性对照,可计为3分。着色细胞百分比计分标准为:<5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%计为2分,51%~75%计为3分,>75%计为4分。两种计分相乘得分值≥2为阳性,<2为阴性。
1.4.2 使用ELISA法检测外周中ANXA7水平:3组研究对象均在晨起空腹采集外周静脉血5 mL,室温离心,血清置于-70 ℃冰箱保存。待测样品孔中每孔加入待测样品100 μl,每种样品设3个平行孔;设2个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100 μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100 μl。按照ELISA试剂盒说明书操作,酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值),收集数据进行统计学分析。
2.1 免疫组化结果:DAB显色后观察,ANXA7在结肠癌组织中多为阳性表达,表达部位主要在胞浆,呈棕黄色,见图1(目录后)。ANXA7在结肠腺瘤性息肉和正常肠黏膜组织中多为阴性或散在表达,见图2-图3(目录后)。
ANXA7在结肠癌组织、结肠腺瘤性息肉组以及健康体检组中的阳性表达率分别为58.57%、20%和14.29%。在结肠癌组织中ANXA7的阳性率明显高于结肠腺瘤性息肉组以及正常肠黏膜组,差异有统计学意义(χ2=38.012,P<0.05),见表1。
表1 3组患者ANXA7表达情况的比较
2.2 ELISA结果:结肠癌组、结肠腺瘤性息肉组以及正常肠黏膜组外周血中ANXA7的水平升高,分别为(6.137±0.965)ng/mL、(2.260±0.950)ng/mL和(2.077±0.844)ng/mL,3组比较差异有统计学意义(P>0.05)。3组间两两比较应用LSD法,结果显示在结肠癌外周血中ANXA7的水平分别高于结肠腺瘤性息肉组以及正常肠黏膜组,差异有统计学意义(P<0.05)。结肠腺瘤性息肉组与正常肠黏膜组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。
表2 3组患者外周血中ANXA7表达水平的比较
2.3 ANXA7在结肠癌组织中表达情况与临床病理特点关系:ANXA7的表达与癌块直径、病变部位无明显相关性(P>0.05)。不同TNM分期、病理分化程度以及淋巴结转移组的ANXA7在结肠癌组织中的阳性表达率不同(P<0.05),即TNM分期偏高者,病理分化程度差、存在淋巴结转移的病例,其ANXA7的表达阳性率相对较高,见表3。
表3 ANXA7在结肠癌组织中表达与临床病理特点的关系[n(%)]
膜联蛋白(ANX)又称会联蛋白(Synexin),ANX 参与细胞分裂、增殖以及磷脂酶 A2 活性的抑制、膜离子通道的形成、胞吞和胞吐、细胞间以及细胞与外基质间的相互作用等多种生理功能[4]。膜联蛋白A家族是一种钙依赖磷脂结合蛋白多基因家族的成员,与多种肿瘤的发生、发展、侵袭及转移有关[5-6]。ANXA7属于膜联蛋白A家族,ANXA7基因位于人类染色体10q21上,这个区域为肿瘤抑制基因所在的区域。通过蛋白质组学分析 Annexin A7 的表达情况,结果表明其在结直肠癌黏膜活检组织中是在正常对照组中的 1.53 倍[7]。研究表明ANXA7基因对肿瘤细胞黏附分子表达及其生物学行为的影响,其可通过影响黏附相关分子FAK、Src、E-cadherin等基因与蛋白表达水平从而改变Hca-P细胞生物学行为[8]。
以往的研究主要集中在前列腺癌和脑胶质细胞瘤等方面,近年发现ANXA7表达可作为胃癌患者预后的重要预测因素[9]。ANXA7的表达与结肠癌的发生、发展、侵袭和淋巴结转移的关系仍有待研究。本研究结果表明,在结肠癌组织中不同TNM分期、病理分化程度以及淋巴结转移组的ANXA7在结肠癌组织中的阳性表达率不同(P<0.05),即TNM分期偏高者,病理分化程度差、存在淋巴结转移的病例,其ANXA7的阳性表达率相对较高,这提示结肠癌患者ANXA7水平与临床病理特征有关,可作为临床评估病情的一项重要指标。文献报道ANXA7在多形性胶质母细胞瘤、黑素瘤和前列腺癌中有抑癌作用[10],但有争议的是,ANXA7在结直肠癌、肝癌、胃癌、鼻咽癌和乳腺癌中有促进恶性肿瘤的发展的作用[11]。本研究也支持ANXA7参与结肠癌的发生、发展。本研究结肠癌组织及外周血中ANXA7的表达明显高于结肠腺瘤性息肉组以及正常肠黏膜组,研究结果支持ANXA7有望成为结肠癌早期诊断的一项肿瘤标记物,对于结肠癌高危人群筛查有重要意义。刘锦新等人[12]研究发现使用免疫组化法检测结直肠癌组织中ANXA7的表达情况,其阳性表达高于癌旁黏膜组织,提示ANXA7在结直肠癌组织中的高表达。本研究结果与其结果一致。但目前研究对于外周血中ANXA7的检测在结肠癌诊断中的敏感度、特异度等问题均需要进一步研究。