贻贝蒸煮液酶解工艺的优化

陶美洁，孟 粉，董 烨，毛海萍，秦求思，戴志远，2*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012）

贻贝（Mytilus edulis）在北方俗称为“海虹”，南方称“青口”、“淡菜”。贻贝产量高，生长力强，是我国主要养殖贝类，其产量占全世界产量的一半以上，目前以冷冻或干制为主要加工手段。在贻贝加工的过程中，每生产1 t 产品，就会产生约1.5 t的蒸煮液[1]。这些蒸煮液含有大量的营养成分，如果直接排入水体不仅会污染环境，还会造成资源的浪费[2]。利用贻贝加工过程的蒸煮液，研制出天然贻贝调味品，不仅解决了资源的浪费问题，还解决了环境污染问题，增加了贝类加工制品的附加值，产生了良好的社会和经济效益。

水产品动物蛋白酶解工艺的研究有很多[3-9]，罗伟等[3]以水解度和苦味评分为指标优化酶解贻贝蒸煮汁液的条件。桑亚新等[4]以回收率和水解度为指标，优化酶解扇贝裙边的条件。王斌等[5]以DPPH 清除率为指标，优化酶解赤魟鱼的条件。本文以水解度为指标，从风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶4 种酶中筛选最适合酶解贻贝蒸煮液的蛋白酶；以酶解时间、温度、pH 值、加酶量做单因素试验，以水解度和风味为指标，采用正交试验优化酶解条件，为后续研究贻贝蒸煮液调味品提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料 样品：浙江省嵊泗县华利水产有限公司提供，由新鲜贻贝的蒸煮液经加热24 h 浓缩而成；F861436 风味蛋白酶，上海麦克林生化科技有限公司；SF-001 复合蛋白酶，西安拉维亚生物科技有限公司；PB180218 胰蛋白酶，普诺赛生命科技有限公司；6384245 木瓜蛋白酶，盐城润雨生物科技有限公司；中性甲醛（分析纯级）、氢氧化钠（分析纯级）、硫酸钾（分析纯级）、硫酸铜（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯级），太仓美达试剂有限公司；浓硫酸（分析纯级），西陇化工股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备 HY-6 型水浴振荡器，太仓市实验设备厂；FE28 pH 计、AL204 型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MYP11-2 磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；Gradient 型Milli-Q 超纯水机，美国Millipore 公司；B-324 凯氏定氮仪，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；50 μm / 30 μm DVB/CAR/PDMS 涂层萃取头，美国Supelco 公司；J-HH-2A 型数显恒温水浴锅，邦西仪器科技（上海）有限公司；Trace GC Ultra 气相色谱-DSQ II 质谱联用仪，美国Theremo Fisher Scientific 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解液的处理 取浓缩好的贻贝蒸煮液100 mL 加热到蛋白酶最适温度后，用盐酸或氢氧化钠调pH 值至最适范围 （风味蛋白酶最适pH 6.5，复合蛋白酶最适pH 7.0，木瓜蛋白酶最适pH 6.0，胰蛋白酶最适pH 7.5）。将称量好的蛋白酶加入酶解罐酶解一定时间后，在沸水浴中灭酶6 min，冷却至室温，于4 000 r/min 离心10 min，所得上清液即为酶解液。

1.2.2 酶解液水解度的测定 采用甲醛电位滴定法[10-12]测定酶解液中氨基酸态氮含量。参考GB5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》[13]的方法测定酶解液中总氮含量。水解度（%）=离心液中氨基酸态氮含量/离心液中总氮含量×100。

1.2.3 蛋白酶种类的筛选 4 种蛋白酶的酶解最适温度、pH 值、酶解时间、加酶量如表1所示，分别在其最适酶解条件下酶解，以水解度为指标，筛选出贻贝蒸煮液酶解的最适蛋白酶种类。

表1 酶制剂的水解条件Table 1 Hydrolysis conditions of enzyme preparation

1.3 单因素试验设计

1.3.1 加酶量对酶解液水解度的影响 加酶量控制为0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，固定水解温度50 ℃，酶解时间3 h，pH 7.0，测定加酶量对酶解液水解度的影响。

1.3.2 酶解时间对酶解液水解度的影响 酶解时间控制为1，2，3，4，5 h，固定水解温度50 ℃，pH 7.0，酶的添加量0.5%，测定酶解时间对酶解液水解度的影响。

1.3.3 pH 值对酶解液水解度的影响 pH 值控制在6，6.5，7，7.5，8，固定水解温度50 ℃，酶的添加量0.5%，酶解时间3 h，测定pH 值对酶解液水解度的影响。

1.3.4 温度对酶解液水解度的影响 温度控制在40，45，50，55，60 ℃，固定酶的添加量0.5%，酶解时间3 h，pH 7.0，测定温度对酶解液水解度的影响。

1.4 响应面设计

参考风味蛋白酶的单因素试验结果，采用响应面方法在4 因素3 水平上对温度、pH 值、酶解时间、加酶量进行优化，根据中心组合设计原理进行设计，分析因素及水平设计见表2。

表2 响应面法分析因素及水平Table 2 Response surface methodology analysis factors and levels

1.5 气相色谱条件

色谱柱：TR-35MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm；载气：He；载气流速：0.8 mL/min；分流方式：不分流；升温程序：40 ℃保持2 min，以4 ℃/min 使温度上升至92 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 使温度上升至200 ℃，再以6 ℃/min 使温度上升至240 ℃，保持6 min。

1.6 质谱条件

电子电离（Electron ionization，EI）离子源，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，传输杆温度250 ℃，质量扫描范围m/z 33～450。扫描方式为全扫描，调谐文件为标准调谐。

2 结果与分析

2.1 酶的选择

以水解度为指标，比较风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶4 种蛋白酶对贻贝蒸煮液酶解的效果。由表3可知，风味蛋白酶相较于其它蛋白酶水解度最高，因此选用风味蛋白酶作为后续酶解酶。

2.2 加酶量的选择

从图1可看出，随着蛋白酶含量的增加，水解度呈上升趋势，到加酶量为0.5%的时候，水解度趋于稳定，这是由于酶浓度逐渐为底物所饱和，而且加入过多的蛋白酶会造成其自水解，会对底物产生一定的影响[14]，综合考虑，酶的添加量选择在0.3%～0.7%较为合适。

表3 不同蛋白酶对贻贝蒸煮液的影响Table 3 Effects of different proteases on mussel cooking liquor

2.3 酶解时间的选择

从图2可以看出，随着酶解时间的增长，水解度呈现先上升后下降的趋势，在酶解3 h 的时候达到最大值。因此，酶解时间选择在2～4 h 较为合适。

2.4 pH 值的选择

从图3可以看出，pH 值为7 的时候，水解度最高。pH 值高于或低于7，水解度都会有所降低，这是因为每一种酶都有其最适pH 值，只有在合适的环境下，酶及底物蛋白质的解离基团才处于易于结合并转化成产物的解离状态，否则酶的活性就会受到抑制，甚至失活。因此在酶解过程中，pH 值选择6.5～7.5 较为合适。

2.5 酶解温度的选择

从图4可以看出，温度在40～50 ℃范围内，水解度一直处于上升状态，这是因为在酶解温度低于酶的最适温度前，温度对水解度的影响处于主导地位。随着温度的升高，分子运动剧烈，酶与底物的接触机会增加，反应速率加快，水解度升高。温度为50 ℃时，水解度达到最高；50～55 ℃时，水解度趋于稳定；但高于55 ℃时，水解度明显下降，这是因为酶是一种活性蛋白质，当温度过高时，其结构发生改变，导致其活性降低，反应速率降低。因此，综上分析酶解温度选择45～55 ℃较为适宜。

图1 加酶量对水解度的影响Fig.1 Effects of enzyme amount on hydrolysis degree

图2 酶解时间对水解度的影响Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree

图3 pH 值对水解度的影响Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree

图4 酶解温度对水解度的影响Fig.4 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis degree

2.6 响应面试验及方差分析

试验设计及结果见表4，利用Design Expert 8.0 软件对所得数据进行回归分析，对各因素回归拟合之后，得到回归方程为：Y=+13.86+0.13X1-0.17X2+0.088X3+0.20X4+0.11X1X2-0.027X1X3+0.045X1X4+7.500×10-3X2X3-0.11X2X4-0.030X3X4-0.22X12-0.30X22-0.22X32-0.18X42。

由表5可知，模型P＜0.0001，说明响应面回归模型极显著；失拟项P=0.4624＞0.05 不显著，说明该回归方程能较好的拟合真实的响应面。从X1，X2，X3，X44 个因素对水解度的影响来看，因素X1，X2，X3，X4，X12，X22，X32，X42对结果影响显著（P＜0.05），X1X2，X2X3，X2X4，X3X4对结果影响不显著（P＞0.05）。通过比较方程一次项系数绝对值大小，可以判断因素影响的主次性[15]，本试验影响因素大小排序为X3＞X4＞X2＞X1。

分别将模型中的4 个因素两两固定，其中2个固定在0 水平，得到另外2 个因素交互作用对水解度Y 的子模型，图5～10 为4 个因素两两交互对水解度影响的响应面图。

表4 风味蛋白酶酶解贻贝蒸煮液响应面优化试验方案及结果Table 4 Optimization of the response surface of the flavored protease digestion of the mussel cooking liquor and its results

表5 水解度回归模型方差分析表Table 5 Analysis of variance on degree of hydrolysis regression model

（续表5）

图5 酶解温度和pH 值交互作用的响应面Fig.5 Response surface of enzymatic hydrolysis temperature and pH interaction

图6 温度和酶解时间交互作用的响应面Fig.6 Response surface of temperature and enzymatic hydrolysis time interaction

图7 酶解温度和加酶量交互作用的响应面Fig.7 Response surface of enzymatic hydrolysis temperature and enzyme addition amount interaction

图8 pH 值和酶解时间交互作用的响应面Fig.8 Response surface of pH and enzymatic hydrolysis time interaction

图9 pH 值和加酶量交互作用的响应面Fig.9 Response surface of pH and enzyme addition amount interaction

经响应面分析得到4 个影响因素的最佳组合为酶解温度51.08 ℃，pH 6.87，酶解时间3.26 h，加酶量0.63%，预测的水解度为13.9805%。为了检验模型预测的准确性，在温度51 ℃，pH 6.9，酶解时间3.3 h，加酶量0.63%的酶解条件下进行试验，测得水解度为14.01%，与预测值基本接近，表明预测值和真实值具有一定的拟合性，进一步验证了模型的可行性。

图10 酶解时间和加酶量交互作用的响应面Fig.10 Response surface of time and enzyme addition amount interaction

2.7 风味成分分析

2.7.1 从响应面试验中挑选8 组不同水解度的样品并选取最佳试验条件为第9 组样品进行风味分析。

表6 风味分析所用样品列表Table 6 Sample list of flavor analysis

2.7.2 酶解后贻贝蒸煮液气质色谱图及成分含量从表7中可以看出：样品1 中检测到47 种风味成分；样品2 中检测到43 种风味成分；样品3 中检测到45 种风味成分；样品4 中检测到42 种风味成分；样品5 中检测到48 种风味成分；样品6中检测到40 种风味成分；样品7 中检测到46 种风味成分；样品8 中检测到45 种风味成分；样品9 中检测到44 种风味成分。其中2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-甲基-5-异丙基吡嗪、2-乙基-3，6-二甲基吡嗪、2，3-二乙基-5-甲基吡嗪、3，5-二甲基-2-丙基吡嗪、2-乙基-3，5，6-三甲基吡嗪、2，5-二甲基-3-（2-甲基丁基）吡嗪、2，5-二甲基-3-（3-甲基丁基）吡嗪、2-丁基-3，5-二甲基吡嗪、三甲胺、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯甲醛、糠醇、十三醇、2-壬酮、2，4-二叔丁基苯酚、乙酸甲酰酯、甲基环戊烯羧酸酯、甲氧基苯肟、2-乙酰基吡咯、5，7-二甲基-1H-吲唑等24 种香气成分在9 种样品中都可以检测到。

贻贝蒸煮液酶解后吡嗪类化合物的含量大大增加，高于其它种类化合物，成为主要化合物，这是因为热加工过程中发生的美拉德反应和热解反应以及酶解反应，均可以产生吡嗪类化合物。从表7中可以看出，2，5-二甲基吡嗪和2-乙基-3，6-二甲基吡嗪在9 种样品中的含量均超过10。其中2，5-二甲基吡嗪均超过20，是各样品中含量最高的挥发性成分，其阈值较低，含有炒花生香气和巧克力、奶油气味等香气，符合人们的嗅觉嗜好，因此是酶解反应增香贡献最大的物质[16-18]。样品9 中吡嗪类化合物含量最高，其次为样品4，含量最低的是样品6。

图11 样品1 的气质色谱图Fig.11 Gas chromatogram of sample 1

图12 样品2 的气质色谱图Fig.12 Gas chromatogram of sample 2

图13 样品3 的气质色谱图Fig.13 Gas chromatogram of sample 3

图14 样品4 的气质色谱图Fig.14 Gas chromatogram of sample 4

图15 样品5 的气质色谱图Fig.15 Gas chromatogram of sample 5

图16 样品6 的气质色谱图Fig.16 Gas chromatogram of sample 6

醛类物质的阈值很低，尽管含量不高，但也对贻贝蒸煮液的风味产生了很大的影响[17]。然而，不同类型的醛类表现出不同的气味，2-甲基丁醛和苯甲醛产生蜡香、香草等香气，3-甲基丁醛具有类似植物的清香特征。在所有样品中，样品9 醛类化合物的含量最高，其次为样品1，这2 种样品醛类化合物的含量遥遥领先其它样品。碳氢类化合物的阈值很高，对酶解液的整体风味贡献不大。

图17 样品7 的气质色谱图Fig.17 Gas chromatogram of sample 7

图18 样品8 的气质色谱图Fig.18 Gas chromatogram of the sample 8

图19 样品9 的气质色谱图Fig.19 Gas chromatogram of the sample 9

呋喃、吡咯、噻唑等杂环类物质阈值极低，对酶解液风味有较大的贡献[19]。呋喃类物质是一种非常典型的风味物质，具有很强的肉香味，它主要是由糖分解和美拉德反应生成，主要贡献豆香、甜香、焦糖香等气味[20]。这几种化合物在样品9 中都含有，虽然含量很少但是阈值低，因此对蒸煮液的风味也有一定的贡献。

醇类化合物大部分是由脂质氧化分解形成的。在检测出来的醇类化合物中，糠醇的含量最高，其阈值很低为0.4，具有甜香、发酵香气等风味成分[21]，对贻贝蒸煮液的风味有一定的贡献，经常作为食品添加剂的原料，是一种增香剂。饱和脂肪醇的阈值都很高，含量不高时对酶解液的风味无影响，但不饱和脂肪醇的阈值很低，对酶解液的风味有很大贡献[22-23]。在所有样品中，样品5 的醇类化合物含量最高，其次为样品9。

从风味方面来看，样品9 检测出来的峰数量最多，对贻贝蒸煮液风味起重要作用的醛类化合物和吡嗪类化合物含量相较其它样品更高；从水解度方面来看，9 号样品的水解度也高于其它样品，因此认为样品9 是最佳样品。

表7 9 种样品挥发性成分含量Table 7 Volatile component content of nine kinds of sample

3 结论

以贻贝蒸煮液为原料，比较风味蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶4 种酶水解贻贝蒸煮液的能力，筛选出风味蛋白酶为最适蛋白酶。在单因素试验的基础上确定酶解各因素的最适范围，以水解度为指标，采用响应面分析法确定酶解的最佳条件为：加酶量0.63%，温度51 ℃，酶解时间3.26 h，pH 6.87。根据正交试验方法从响应面分析设计的样品中挑选了8 组不同水解度并且具有代表性的试验样品与酶解最佳条件的样品进行风味分析。由于样品9 中对风味起决定性作用的醛类和吡嗪类化合物的含量均位于第一，而且其测出的峰个数和风味成分含量都是最高的，因此确定样品9 为最佳样品。