分子蒸馏纯化花生油甘油二酯及其成分变化研究

郭婷婷，曾俊鹏，彭 斌，李 静，邓泽元

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

甘油二酯（DAG）是指甘油中两个羟基与脂肪酸发生酯化反应得到的产物，是一种功能性油脂，它分为1，3-甘油二酯和1，2-甘油二酯两种异构体。研究表明其具有减少内脏脂肪的积累、控制体重、降低血脂等功效[1-2]。甘油二酯可广泛应用于食品、药品、化妆品等。相对于化学法，酶法制备甘油二酯具有反应体系条件温和，产品纯度较高，能耗低等优势[3]。以花生油为原料，生产花生油甘油二酯，不但风味独特，而且原料丰富，适于产业化生产。

目前报道分子蒸馏是分离甘油酯的最有效的技术，该技术主要有蒸馏温度低、工作真空度高、物料受热时间短以及分离效果好等优点，适用于高沸点、热敏性及易氧化物料的分离[4]。近几年，油脂中的缩水甘油酯和反式脂肪酸受到国内外研究者的关注。缩水甘油酯对人体具有致癌性，过去日本花王公司生产了“Econa 健康烹调油”，但随后检测机构在其中检测出缩水甘油酯含量超标，致使该产品不能在市场上销售[5]。研究表明缩水甘油酯形成的过程与其前体物质有关，并将前体物质归结为单酰基甘油酯、二酰基甘油酯、三酰基甘油酯和氯[6-8]。油脂在精炼脱臭过程中，高温处理会使反式脂肪酸含量增加[9]。油脂中还存在维生素E、植物甾醇等有益成分[10]，在合成及纯化过程中会有一定的损失。目前未有对分子蒸馏后花生油甘油二酯有益与有害成分的研究。本试验通过分子蒸馏纯化花生油甘油二酯，研究合成与纯化前、后的甘油酯组成、脂肪酸组成、缩水甘油酯（GEs）及营养物质的变化。这对加强控制油脂开发类食品的质量安全，以及油脂行业的发展和人们的身体健康具有重要的科学研究意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲁花一级花生油，南昌天虹超市；脂肪酸标品（GLC463 标样），Nu Chek.Prep 公司；丙三醇、无水硫酸钠、冰乙酸、氯化钠等均为分析纯级试剂；正己烷、甲醇、叔丁基甲醚、异丙醇、苯硼酸等为色谱纯级试剂。Novozym435 脂肪酶，诺维信（中国）生物技术有限公司；3-氯-1，2-丙二酵（3-MCPDd5），加拿大Toronto Research Chemicals 公司。

1.2 仪器与设备

FA2204B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；TDL-5-A 低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；UIC-KDL1 分子蒸馏，德国UIC 公司；DSY-VI 型氮吹仪，北京金科精华苑科技有限公司；DF101S 集热式恒温加热磁力搅拌锅，郑州市亚荣仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；6890N 型气相色谱仪，美国Agilent 公司；HH-4 型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解法生产甘油二酯 利用Novozym 435脂肪酶在无溶剂体系下通过甘油解反应制备甘油二酯，合成条件为：花生油与甘油物质的量比1∶2，加酶量6%，反应时间12 h，反应温度70 ℃。反应结束后将反应体系进行离心，分离反应体系中的脂肪酶后，合成产物低温储存。

1.3.2 分子蒸馏工艺研究 采取两级分子蒸馏从合成产物混合物中分离和纯化甘油二酯。首先，进行一级分子蒸馏将产物体系中的脂肪酸、甘油一酯在较低温度下与酰基甘油混合物分离，一级分子蒸馏条件：蒸馏温度180 ℃和200 ℃，冷凝温度20 ℃，转速200 r/min，真空度0.1 Pa，进料速率2 mL/min，然后通过二级分子蒸馏在200 ℃温度以上从甘油三酯中分离出甘油二酯，考察二级分子蒸馏温度对甘油二酯纯度和得率的影响。

1.3.3 甘油酯纯度测定 采用正相高效液相色谱法测定[11]。测定条件：检测器：蒸发光散射检测器（Model 300S，美国Softa 公司）；色谱柱：Hypersil BDS CPS （5 μm，250 mm×4.6 mm，美国Thermo 公司）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；样品质量浓度：0.2 mg/mL 正己烷；流动相：正己烷（溶有0.4%的乙酸）和叔丁基甲醚（溶有0.4%乙酸）。采用梯度洗脱，洗脱程序：0～5 min，100%正己烷；5～15 min，100%～20%正己烷；15～17 min，20%正己烷；17～17.1 min，20%～100%正己烷；17.1～20 min，100%正己烷。某种甘油酯的含量表示为该种甘油酯的峰面积占总的甘油酯峰面积的百分比。

甘油二酯的纯度定义为[12]：

式中，MAG （%）——产物中甘油一酯含量；DAG（%）——产物中甘油二酯含量；TAG（%）——产物中甘油三酯含量；FFA（%）——产物中游离脂肪酸的含量。

1.3.4 理化性质测定 酸价采用GB5009.229-2016 测定；过氧化值采用GB5009.227-2016 测定；色泽采用GB/T 22460-2008 动植物油脂 罗维朋色泽的测定。

1.3.5 甘油三酯总脂肪酸组成分析 甘油三酯的脂肪酸组成参照本试验碱法甲基化方法[13]：取2 mg 甘油三酯，溶于1.5 mL 正己烷，加入40 μL 乙酸甲酯和100 μL（0.5 mol/L）甲醇钠溶液，涡流混匀1 min，37 ℃下反应20 min 后，置于冰箱下层-20 ℃冷冻10 min，取出后立即加入60 μL 草酸溶液，离心弃去沉淀，N2吹干，GC 分析甘油三酯脂肪酸组成。

1.3.6 气相色谱分析 色谱条件参照Cruz-Hernandez 等[14]，色谱柱为CP-Sil88 熔融石英毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm）。载气为H2，燃烧气为H2、N2和空气。FID 温度250 ℃，进样口温度250 ℃。气相色谱程序升温的时间为86 min：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min 的升温速率将温度升至175 ℃，保持27 min 后再以4 ℃/min 的升温速率升至215 ℃，保持35 min。脂肪酸的分析参照标准图谱，脂肪酸的百分含量采用面积归一化法确定（以峰值面积的百分比表示）。

1.3.7 缩水甘油酯的测定[15]样品处理：称取2份油样0.1 g 于100 μL 甲基叔丁基醚中，再向油样中加入1 μg 3-MCPD-d5，分别标记为A，B，涡旋振荡两支试管至油样完全溶解。再向溶液中加入25 g/L 甲醇钠的甲醇溶液200 μL，涡旋1 min。酯交换反应的时间要控制在3.5～5.5 min 内，不断涡旋直至反应液澄清，试管A 中加入600 μL 酸化的氯化钠溶液（200 g/L），试管B 中加入600 μL 酸化的溴化钠溶液（600 g/L）终止酯交换反应。充分反应后，两支试管中再分别加入600 μL 的正己烷溶液，盖上盖子充分涡旋后离心5 min （4 000 r/min），待反应液分层后去除有机层。此步骤重复3次。衍生反应：对于A，B 试管，分别用600 μL 乙醚/乙酸乙酯混合溶剂（3∶2）反萃取其水相，充分涡旋后离心5 min（4 000 r/min），待溶液分层后把有机相合并在装有少量无水硫酸钠的2 mL 离心管中，此步骤重复3 次。再分别向有机相中加入200 μL 衍生化试剂（PBA 溶于乙醚中饱和），充分涡旋后在30 ℃下反应20 min。纯化复溶：衍生化反应结束后，用小气流氮气吹干，氮吹温度为45℃。氮吹完后，加入500 μL 异辛烷复溶，充分涡旋后离心1 min（6 000 r/min），取200 μL 上层清液转移至GC 瓶中，供GC-MS 分析。气相色谱测定条件：不分流进样，进样体积1 μL，载气为He，1.2 mL/min 恒速流动；升温程序为60 ℃，以6 ℃/min上升至130 ℃，保持8 min，再以20 ℃/min 上升至250 ℃并保持5 min。质谱条件：EI＋，SIM 模式；EI离子源温度230 ℃，EI 电离能量70 eV；接口温度280 ℃；溶剂延迟6 min；选择3-MCPD-d5 m/z 为201，150；3-MCPD m/z 为196，147 定性定量。

1.3.8 甾醇的测定[16-18]精确称取0.05～0.1 g（精确至0.1 mg）的样品置于带盖的试管中，加入5.0 mL 2 mol/L 氢氧化钾的乙醇溶液后加盖密封，剧烈振摇30 s，置于60 ℃水浴中皂化1 h，并保持振摇，用水冷却至室温后加入1.0 mL 二次水和4.0 mL 正己烷，密封后剧烈振摇，静置，将上层（正己烷层）转移至另一试管中，用N2吹干正己烷后加入1 mL 甲醇溶解，用0.45 μm 微孔滤膜滤过并转至进样瓶中，在试验设定条件下进行HPLC 测定。液相色谱分析条件参见江海[16]、冯妹元等[17]和牟德华等[18]的方法，并在此基础上作少许改动，采用二极管阵列检测器（DAD），条件如下：色谱柱：Hypersil ODS2-C18 （5 μm，4.6 mm 150 mm）流动相：纯甲醇。流速：1.0 mL/min。检测波长：210 nm。柱温：30 ℃。进样量：10 L。分析时长：20 min。

1.3.9 维生素E 的测定[19]称取一定量VE 标品，记录下质量，用正己烷定容。再从其中依次分别精确移取0.5，1，2，3，4，6 mL，稀释至10 mL。采用HPLC 分析，每个样品平行测3 次，绘制标准曲线。样品预处理：准确称取1 g 菜籽油于10 mL 棕色容量瓶中，正己烷定容。经0.45 μm 有机膜过滤后进样。

色谱柱：依利特Hypersil ODS2 （5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相为甲醇：水（体积比98∶2），进样5 μL，流速设置为0.8 mL/min，紫外检测波长：λex=295 nm，柱温：25 ℃。

1.4 统计方法

用SPSS 20.0 对数据进行分析以及图表绘制，检测结果用Mean±SD 表示；所有试验均重复3次以上，并且用单因素方差分析比较均值，P＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 合成及分子蒸馏前、后甘油酯组成液相色谱图

图1 标准品、合成产物、分子蒸馏一次及二次液相图谱Fig.1 HPLC chromatogram of standard，synthesis product，one and two-step molecular distillation

图1分别为混合甘油酯标准品、合成甘油酯及分子蒸馏一次和二次的液相图谱，横坐标为时间，纵坐标为响应信号，出峰顺序依次为FFA、TAG、1，3-DAG、1，2-DAG 和MAG，分离效果很好。分子蒸馏一次后可除去游离脂肪酸和甘油一酯。分子蒸馏二次后可只保留甘油二酯组分。

2.2 分子蒸馏前、后甘油酯组成含量及得率

分子蒸馏是一种在高真空下操作的蒸馏方法，这时蒸气分子的平均自由程大于蒸发表面与冷凝表面之间的距离，从而可利用料液中各组分蒸发速率的差异，对液体混合物进行分离。当温度越高时，分子运动平均自由程越大，则轻、重组分分离效果越好，但高温会使所分离物质的品质受到一定程度的影响，如颜色会加深。因而蒸发面温度是影响分离效果的关键因素[20]。

表1 分子蒸馏前、后甘油二酯的含量及得率Table 1 Compositions and yield of DAG before and after molecular distillation

如表1所示，利用酶法合成甘油酯中甘油二酯的纯度为45%，经过180 ℃和200 ℃分子蒸馏后，除去了甘油一酯和游离脂肪酸，甘油二酯提高到65%以上。当对一次分子蒸馏产物进行二次分子蒸馏后，随着温度的升高，甘油二酯的纯度可达88%，这是因为随着蒸发面温度的升高，物料中轻组分获得的能量更多，分子运动加剧，快速馏出。但甘油二酯产率较低，仍有甘油二酯流入重相[21]。

2.3 分子蒸馏前、后脂肪酸及反式脂肪酸组成及含量

油脂中的不饱和脂肪酸在高温条件下易产生反式脂肪酸，因此对反应前后及分子蒸馏产物脂肪酸组成及含量进行测定。

由表2可知，花生油甘油二酯经分子蒸馏后脂肪酸组成变化不大，仍以油酸和亚油酸为主，棕榈酸与硬脂酸其次，但不饱和脂肪酸远高于饱和脂肪酸。从产物中甘油二酯和甘油三酯的脂肪酸组成可知，各种脂肪酸与甘油或者甘油酯酯化的机会不均等，Selmi 等[22]比较过不同链长饱和脂肪酸及相同链长不同不饱和度的不饱和脂肪酸的酯化机会，研究发现在酯化的过程中，C14-C18 的饱和脂肪酸酯化速度最快，其次为C18：1等单不饱和脂肪酸，最后为C18：2和C18：3等多不饱和脂肪酸。因此反应产物中的甘油二酯和甘油三酯中饱和脂肪酸增加。

油脂在高温加热过程中易形成反式脂肪酸[23]，合成产物中顺式油酸9c-C18：1高温异构化后形成了极少量的9t-C18：1；顺式亚油酸9c12c-C18：2高温异构化形成了9c12t-C18：2，9t12c-C18：2和少量的9t12t-C18：2；Li 等[24]对亚油酸异构化的研究认为，形成单反式脂肪酸仅需跨越一个能垒，因此在一定时间范围内含量更高。分子蒸馏过程温度虽在180 ℃和220 ℃，但反应时间较短，因此反式脂肪酸含量较低，仅从0.75%增加至1.2%，未超过国家规定3%。控制高温时间，是控制油脂中反式脂肪酸含量的有效途径。

2.4 分子蒸馏温度对缩水甘油酯的含量的影响

由图2所示原料花生油及合成甘油酯中缩水甘油酯的含量很低，说明酶催化反应过程中不会产生缩水甘油酯，该结果与文献报导[25]的结果是一致的。经不同温度下一次及二次分子蒸馏后，当温度超过220 ℃后，缩水甘油酯的含量急剧增加，富集在轻相甘油二酯中。Craft 等[6-7]发现甘油二酯与缩水甘油酯的形成有很强的相关性。Shimizu等[26]对二油酸甘油酯在180 ℃到240 ℃下封闭热处理产生3-MCPD 酯和缩水甘油酯的趋势进行考察，发现缩水甘油酯的产生量随温度的升高而增加，且当热处理温度高于220 ℃时油酸缩水甘油酯的产生量迅速增加，对于二次分子蒸馏后的甘油二酯会含至少2 mg/kg 的缩水甘油酯，如要提高得率，需要进行缩水甘油酯的去除。因此分子蒸馏温度是影响缩水甘油酯产生的重要因素。

表2 反应前、后及分子蒸馏产物脂肪酸组成及含量Table 2 Fatty acid compositions of product before and after the reaction and molecular distillation

图2 分子蒸馏温度对缩水甘油酯含量的影响Fig.2 Effect of molecular distillation temperature on the content of glycidyl ester

2.5 分子蒸馏前、后理化性质的变化

由表3所示产物相关理化性质的检测，合成产物会生成游离脂肪酸，因此酸价较高。分子蒸馏后脱去了游离脂肪酸及过氧化物后其酸价和过氧化值降低，其值都在国标范围内，但高温会使所分离物质的品质受到一定程度的影响，如颜色会加深[20]。因此分子蒸馏后油脂颜色加深，缩水甘油酯的含量在220 ℃条件以下会有一定量的累积，因此考虑甘油二酯的得率的同时需检测缩水甘油酯的含量并除去。

2.6 分子蒸馏前、后植物甾醇和维生素E 的含量变化

由表4所示油脂中营养物质的变化，花生油中含有VE 32.76 mg/100 g 和甾醇318.46 mg/100 g，反应合成前后和分子蒸馏前后维生素E 和甾醇都有一定量的损失，维生素E 损失最高，分子蒸馏一次后损失率达43%，高温和高真空会使油脂发生轻微氧化，氧化时一般先损耗包括VE 在内的抗氧化成分，因此维生素E 损失率严重。有研究表明[27]分子蒸馏可以富集维生素E 和甾醇，DAG 中VE 和甾醇有累积，但是需要额外添加抗氧化剂等营养成分。

表3 反应前、后及分子蒸馏产物理化性质的变化Table 3 Changes of physicochemical properties of product before and after the reaction and molecular distillation

表4 反应前、后及分子蒸馏产物植物甾醇和VE 含量的变化Table 4 Changes of phytosterol and VE content of product before and after the reaction and molecular distillation

3 结论

本试验通过分子蒸馏技术纯化花生油甘油二酯。在180 ℃分子蒸馏一次后可除去游离脂肪酸和甘油一酯，220 ℃二次分子蒸馏后可得到纯度85%，得率18.54%的甘油二酯，分子蒸馏后脂肪酸组成变化不大，其中饱和脂肪酸增加，反式脂肪酸含量较低，仅从0.75%增加至1.2%，当温度超过220 ℃后，缩水甘油酯的含量急剧增加，因此二次分子蒸馏的温度不应超过220 ℃。根据理化性质分析，花生油甘油二酯符合国家标准。分子蒸馏前后营养成分均会减少，维生素E 的含量从32.76降到19.43 mg/100 g，损失40%左右，植物甾醇的含量从318.46 降到248.6 mg/100 g，损失22%左右，本研究为分子蒸馏纯化甘油二酯提供理论支持。