2019-nCoV特异性抗体在新型冠状病毒感染检测中的应用价值

马蓓洁，贾同乐，戴冬雪，郝亚茹，韩梦思，孙 洋，杨 松，蔡会欣

(保定市第一中心医院医学检验科，河北 保定 071000)

2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)是目前发现的第7种可感染人类的冠状病毒[1]，其感染所致的疾病称为COVID-19(Corona Virus Disease 2019)[2]。COVID-19是以肺部病变为主的新发传染病，可引起消化系统和神经系统损伤，严重者可导致死亡[3]。我国卫生健康委员会将该病纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。2020-02-28日，世界卫生组织将疫情全球风险级别由“高”上调至“非常高”；2020-3-11日，宣布新冠肺炎疫情进入“全球大流行”状态[4]。国际疫情爆发式增长，早期诊断、及时隔离治疗对有效控制疫情至关重要[5]。

1 新型冠状病毒肺炎诊疗方案中有关实验室诊断依据的变化

《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第三版)》指出，在符合疑似病例诊断标准的基础上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本行实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸呈阳性结果或病毒基因测序与已知新型冠状病毒高度同源即可确诊。第四版中RT-PCR的标本类型增加血液标本；第五版增加粪便标本；第六版强调“为提高核酸检测阳性率，建议尽可能留取痰液，实施气管插管患者采集下呼吸道分泌物，标本采集后尽快送检。”以上几版中，对疑似病例的确诊条件均为找到“病原学依据”，即“核酸检测阳性”或“基因测序与已知新冠病毒同源”。在2020-03-03日印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，疑似病例的确诊方法在原有核酸检测和测序基础上增加“血清学检测”，即“新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性”或“新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”[6]。

2 2019-nCoV核酸检测的局限性

基因测序技术诊断2019-nCoV感染准确度高，但测序所需的实验时间相对较长，而且设备要求较高[7]，不适于临床快速大批量筛查及诊断。RT-PCR核酸检测技术具有高灵敏度和高特异性[8]，但RT-PCR核酸检测的结果受多因素多环节的影响[9]，例如试剂盒的准确性和重复性[10]、标本的类型、保存与运输(RNA易降解)、患者感染周期及人员操作等[11]，容易造成病毒核酸检测的“假阴性”问题。

3 2019-nCoV特异性抗体检测

针对核酸检测“假阴性”问题，有研究提出应补充新冠病毒特异抗体检测，抗体协同核酸检测可用于辅助诊断和快速筛查[12]。

3.1 2019-nCoV特异性抗体的产生

通常情况下，机体感染病毒时，首先诱发固有免疫应答，通过I型干扰素抑制病毒，当病毒遇到自然杀伤细胞后，后者通过细胞裂解作用将被病毒感染的细胞清除。但病毒一旦完成入侵并造成感染，便会诱发特异性免疫应答。病毒表面分子与宿主细胞表面相应受体结合，机体针对病毒表面分子产生特异性抗体。病毒初期感染以诱导IgM抗体产生为主，感染后IgM迅速达到峰值，但持续时间较短，浓度较低，是急性感染期的诊断指标；中后期则以诱导IgG抗体产生为主，IgG浓度高，持续时间长，即使痊愈后也能长时间维持高水平，提示感染中后期或既往感染[12-13]。

一项关于严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)即非典型肺炎的血清学研究发现，患者发病后7 d左右血清中出现IgM抗体，10 d时IgM达到高峰，15 d左右开始下降；发病后10 d左右血清中出现IgG抗体，20 d左右IgG达到高峰；另有研究报道并非所有SARS患者都产生抗体[14]。

SARS病毒的S蛋白可结合宿主细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)从而感染细胞，有研究人员在细胞实验中发现ACE2对2019-nCoV进入细胞也是必需的[15]，而且2019-nCoV与ACE2之间具有很强的亲和力[16]。提示我们也许可以根据SARS抗体研究的结果推测2019-nCoV抗体产生的规律。

有研究[17]报道了1例COVID-19患者血清抗体水平的变化情况，研究对象为一名澳大利亚墨尔本市的非重症COVID-19患者，研究人员对该患者进行了从患病开始为期20 d的追踪观察。该患者发病后7 d核酸检测转阴，11 d出院隔离，13 d相关症状消失，20 d状态良好，并未复发。研究者采用感染了2019-nCoV的Vero细胞进行免疫荧光抗体实验，检测患者血清中IgG和IgM水平，结果发现从发病后7 d到20 d，患者血清中IgG和IgM抗体水平呈逐渐升高的趋势[17]。

COVID-19患者发病后IgM最早何时产生，徐云云等[18]的研究有所提及。采用免疫荧光法和胶体金法检测IgM抗体，发现IgM抗体最早可在感染后的3 d内产生；从病程来看，发病1、2、3周及1个月阳性率逐渐升高，1个月后降低，推测IgM抗体在感染2019-nCoV后的1周内即可产生，并可持续存在1个月不消失。但该研究中各病程样本例数较少，病程为发病3 d的病例仅3例，总病例仅80例，尚不能完全反映COVID-19患者体内特异性抗体产生及变化规律。

3.2 特异性抗体的实验室检查方法

国家药品监督管理局已经批准了几种用于辅助诊断2019-nCoV感染的抗体检测试剂盒，检测方法包括化学发光法、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金法，检测指标有总抗体、IgM抗体和IgG抗体。

3.2.1 化学发光法

化学发光法是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的检测方法，用于各种抗原、抗体、激素的检测。iFlash 3000化学发光免疫分析仪通过直接化学发光技术间接免疫法检测2019-nCoV IgG/IgM。首先包被2019-nCoV抗原的磁珠和血清样本中的IgG/IgM抗体结合，形成抗原-抗体复合物，随后与鼠抗人IgG或IgM抗体吖啶酯标记物孵育形成抗原-抗体-二抗复合物，复合物浓度与化学发光信号强度成线性关系，最后计算得出抗体浓度。化学发光法具有特异性高、线性范围宽、结果稳定、操作简化等特点，广泛应用于临床标本的检测[19-20]。

3.2.2 酶联免疫吸附法(ELISA)

ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，并根据酶催化底物产生的颜色反应判定相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。Ning等[21]采用双抗原夹心法和μ链捕获法检测总抗体和IgM抗体。邱峰等[22]指出ELISA法的实验室操作要求相对较低，适用于筛查及流行病学调查，但其敏感性、特异性、临床应用效率还需要进一步的验证和评估。

3.2.3 胶体金法

胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术。血清中的2019-nCoV IgG/IgM抗体与胶体金标记的2019-nCoV抗原结合形成复合物，该复合物在包被的鼠抗人IgG/IgM抗体处被捕获，与之结合形成复合物，呈现紫红色条带。胶体金技术具有方便快捷、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,特别适合于基层检验及大批量检测等[23]。

3.3 不同方法检测2019-nCoV特异性抗体灵敏度和特异性的差异

唐鹏等[24]将191例就诊于武汉雷神山医院的确诊和疑似COVID-19患者按照入院及实验开始时的核酸检测结果分为3组：2019-nCoV持续阳性组、2019-nCoV阳转阴组及2019-nCoV疑似组，采集血清样本，分别采用胶体金法和化学发光法检测各组IgM和IgG总抗体及IgM抗体。结果表明，持续阳性组胶体金法和化学发光法总抗体阳性检出率无明显差异；阳转阴组和疑似组化学发光法总抗体阳性检出率明显高于胶体金法(95.2% vs 76.2%，94.9% vs 70.5%)，差异有统计学意义(P<0.05)。Ning等[21]采用3种方法(化学发光法、ELISA法和胶体金法)检测总抗体和IgM抗体，发现这3种方法检测总抗体和IgM的敏感性和特异性均较高，差异无统计学意义(P<0.05)。徐云云等[18]采用荧光免疫法和胶体金法分别对COVID-19患者和对照人群(2019-nCoV流行期间经临床诊断排除COVID-19者)血清IgM抗体进行检测，结果显示荧光免疫法检测总阳性率略高于胶体金法(88.75% vs 81.25%)。上述方法均具有操作方便、高效快捷、高敏感性的特点，但唐鹏等[24]和Ning等[21]的研究结果有一定的差异，推测原因可能是两项研究中患者采血时间不同，唐鹏等的研究按照病程分组，而Ning等的研究未注明患者病程情况。

3.4 血清总抗体检测在2019-nCoV感染中的筛查诊断价值

Zhao等[25]采用双抗原免疫夹心法、IgM μ-chain捕获法和间接ELISA法对173例COVID-19确诊患者发病后不同时间点的535个血清标本进行总抗体、IgM抗体和IgG抗体检测，发现血清中总抗体、IgM抗体、IgG抗体的血清转化依次出现，中位时间分别为11、12、14 d，即总抗体的平均血清转化时间分别比IgM抗体和IgG抗体早1 d和3 d，提示总抗体较IgM抗体和IgG抗体可能是更好的血清学诊断指标，可用于早期筛查或诊断。唐鹏等[24]的研究中，患者起病时间到抗体采集时间总中位数为25 d，范围为3～47 d，表明患者病程分布较广，但总抗体检测仍表现出较好的诊断阳性率[24]，提示总抗体在不同病程中均具有筛查或诊断价值。

4 血清抗体联合核酸检测在2019-nCoV感染诊断中的应用价值

病毒感染机体后，通过激活B淋巴细胞产生抗体，需要一定时间，从而形成抗体检测的“空窗期”，且由于个体差异，不同个体“空窗期”的时间亦有所不同[18]。早期IgM抗体可能还未产生或呈低浓度水平，抗体检测可能产生假阴性结果；随着感染时间的延长，IgM抗体亦逐渐减少甚至消失。因此，在抗体检测的基础上联合使用RT-PCR核酸检测，可显著提高不同病程COVID-19患者的检出率。

Zhao等[25]研究发现，在COVID-19发病7 d内的早期阶段，RT-PCR核酸检测的敏感性远高于抗体检测(66.7% vs 38.3%)；但从发病第8天开始，抗体检测的敏感性就超过了核酸检测，发病第12天达到90%以上；在发病8～14 d的患者样本中，总抗体、IgM和IgG的敏感性分别为89.6%、73.3%和54.1%，均高于核酸检测的54.0%；在发病15～39 d的晚期阶段，总抗体、IgM和IgG的敏感性分别为100.0%、94.3%和79.8%，而核酸检测敏感性仅为45.5%。因此，在COVID-19的诊疗过程中，核酸检测和抗体检测互为弥补，联合检测有利于2019-nCoV的筛查、确诊及治疗。

5 小 结

抗体检测具有采样方便、快速高效、高敏感性和高特异性的特点，在对2019-nCoV感染者进行筛查或诊断时，可根据患者病程选择合适的抗体检测方法，同时联合核酸检测，可显著提高不同病程COVID-19患者诊断的敏感性及2019-nCoV感染的筛查及诊断效率。