程序性死亡蛋白-1抑制剂在晚期肝细胞癌治疗中的应用及其免疫机制探讨

刘少东，马艳波，郑冰峰

山西医科大学第一医院肝胆外科，山西 太原 030001

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，国家癌症中心于2018年发布最新数据显示，在2000年至2014年我国肝癌发病率和死亡率有所下降，然而目前其发病率仍高居恶性肿瘤第4位，在癌症致死原因中排名第2位[1]。其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在原发性肝癌中占75%～85%，而我国北方地区为83.9%～92.3%[2-3]，且多为中晚期患者。目前对于不能手术切除的晚期HCC患者，小分子多激酶抑制剂索拉非尼是全身治疗首选，但并无证据表明索拉非尼对乙肝病毒阳性和丙肝病毒阴性患者总体生存时间有明显改善[4]。而以程序性死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1，PD-1)抑制剂为代表的免疫疗法在晚期HCC治疗中受到广泛关注，并已有相关研究证明,PD-1抑制剂对于晚期HCC患者有良好的疗效和安全性[5]。本文综合国内外研究进展，就PD-1抑制剂在晚期HCC治疗中的应用及其免疫机制进行讨论和分析，旨在为晚期HCC免疫治疗提供理论基础。

1 PD-1抑制剂

PD-1分子作为CD28家族中的一种I型跨膜糖蛋白由PDCD1基因编码。它由288个氨基酸组成，在胞质区的尾部有两个可磷酸化的酪氨酸残基，在胞外区由信号肽、N环、IgV结构域(N端具有4个糖基化位点)组成[6]。PD-1可由细胞因子诱导性表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、胸腺细胞和肿瘤浸润淋巴细胞表面。PD-1分子与其主要配体程序性死亡蛋白配体-1(programmed cell death protein ligand-1，PD-L1)结合产生抑制信号，限制效应T细胞的活性，减少T细胞增殖和细胞因子产生[7]，从而导致肿瘤细胞免疫逃逸，且肿瘤细胞本身也可以通过表达PD-L1实现免疫逃逸。因此，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路，能够增加自然杀伤细胞在机体的浸润、杀伤作用，恢复T细胞抗肿瘤活性，改善免疫抑制状态，增强抗肿瘤免疫应答[8]。

目前临床已开发出几种抑制PD-1途径的试剂，此类试剂主要通过阻断PD-1与PD-Ls(PD-L1和PD-L2)的结合实现药物作用。其中，PD-1抑制剂派姆单抗(Pembrolizumab)具有可结晶片段(Fc)区域，可将抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)降至最低[9]，而PD-1抑制剂纳武单抗(Nivolumab)作为基因工程改造的IgG4单克隆抗体，无明显ADCC或CDC[10]，因此两者作为免疫检查点阻断剂已应用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗及临床研究中，并取得了一定的疗效[11-12]。

2 PD-1抑制剂在晚期HCC治疗中的应用

目前，虽然免疫检查点抑制剂作为免疫治疗的代表药物在各类肿瘤临床试验中均取得了良好的疗效，但是针对晚期HCC的临床试验研究相对较少。不过基于一定的理论基础可以说明免疫治疗在晚期HCC中能够发挥有效作用。首先，肝癌与炎症相关，其次免疫治疗药物在肝脏中不代谢，在肝硬化患者中可能具有可预测的药物代谢动力学特征[13]。另外T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和PD-1/PD-Ls免疫检查点抑制剂在晚期HCC治疗中诱导抗肿瘤作用取得的成果也进一步证明免疫治疗的可行性[14-15]。

PD-1抑制剂Nivolumab是IgG4单克隆抗体，2017年9月已被美国食品与药品管理局(FDA)批准作为晚期HCC的二线治疗药物[16]。一项关于Nivolumab治疗晚期HCC患者Ⅰ/Ⅱ期临床试验研究结果显示[5]，在剂量递增组(0.1～10 mg/kg)患者客观缓解率为15%，疾病控制率为58%，中位缓解持续时间为17个月，6个月、9个月总生存率均为66%，剂量递增实验确定了该药物安全的可控性和耐受性可接受。队列扩展组(3 mg/kg)客观缓解率为20%，疾病控制率为64%，中位缓解持续时间为9.9个月，6个月和9个月总生存率分别为83%和74%，以上结果表明，Nivolumab对于晚期HCC患者有良好的疗效和安全性，并且表现出疗效长久持续的特点，这也是化疗和靶向治疗所不具备的。目前为进一步证明Nivolumab在晚期HCC中的有效性，一项比较Nivolumab与索拉非尼治疗晚期HCC患者疗效和安全性的Ⅲ期临床试验仍在进行[17]，或许该研究结果能为晚期HCC患者带来新希望。

Pembrolizumab是另一种针对PD-1具有高度选择性的IgG4单克隆抗体。一项Pembrolizumab的Ⅱ期临床试验(KEYNOTE-224)研究[18]表示，在索拉非尼治疗失败或不耐受的晚期HCC患者中，Pembrolizumab治疗的客观缓解率为17%，疾病控制率为51%，与治疗相关的不良事件发生率为73%，其中3级、4级不良事件发生率分别为24%和1%，但并无病毒感染病例的报道。另外患者的疾病进展生存时间和无进展生存时间的中位数均为4.9个月，中位总体生存期为12.9个月，这也表明Pembrolizumab是作为晚期HCC患者一种有效的治疗选择。在对晚期HCC进行Ⅱ期研究之后，目前正在进行Pembrolizumab Ⅲ期安慰剂对照研究[19]，以进一步检测对索拉非尼治疗失败或不耐受的晚期HCC患者使用Pembrolizumab的疗效。

尽管PD-1抑制剂Nivolumab和Pembrolizumab单药研究在晚期HCC中取得一定疗效，但晚期HCC患者也面临药物相关毒性的问题。因此通过药物组合的方式，有可能进一步增强与HCC相关的免疫应答，同时可能更容易控制其安全性，例如正在进行的Nivolumab与抗KIR单抗Lirilumab联合使用的研究(临床研究NCT01714739)和Nivolumab与Galunisertib联合使用的研究(临床研究NCTO2423343)[20]。另外我国研发的PD-1单抗SHR-1210联合阿帕替尼治疗的8例可评价疗效的HCC患者中，客观缓解率和疾病控制率分别为50%和93.8%[21]，所以也进一步表明PD-1单抗联合抗血管生成靶向药物有治疗晚期HCC的潜力。因此，PD-1抑制剂与免疫抑制剂或抗血管生成药物联合治疗的阶段性成果均提示联合用药抵抗肿瘤形成的作用，这也是治疗肿瘤的一个重要研究方向。

3 PD-1抑制剂在晚期HCC治疗中的免疫机制

3.1 PD-1/PD-Ls的表达与肿瘤免疫逃逸PD-1主要表达于CD8+T细胞，也可在调节性T细胞和骨髓来源的抑制性细胞上表达，肝脏中的肝星状细胞、Kupffer细胞等也可表达高水平PD-1和PD-L1[22]，并且干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10等多种细胞因子可上调PD-L1分子在不同细胞中表达[23]。一般生理情况下，PD-1/PD-Ls信号通路的激活与机体免疫耐受相关，能够避免自身免疫活化过度及其对机体组织造成免疫损伤[24]，起到一定的免疫保护作用。在肿瘤微环境中，癌细胞表面则是通过由炎性细胞因子干扰素-γ诱导表达配体PD-Ls并激活该信号通道逃避免疫监视，另外肝癌组织与癌周组织相比，能够表达更高水平的PD-L1免疫抑制分子，使T淋巴细胞在肝癌组织内的浸润明显减少[25]，这也间接为肝脏肿瘤细胞免疫逃逸提供证据。因此，基于目前研究结果,无论是生理条件下的免疫耐受或病理条件下的肿瘤免疫逃逸,均可能与PD-1/PD-Ls信号通路相关。

3.2 PD-1/PD-Ls下游信号通路当活化T细胞表面的PD-1与配体PD-Ls结合后可通过PI3K/AKT/mTOR和RAS/EMK/ERK两条信号通路向T细胞传递负向调控信号并引发T细胞进入静息状态。PD-1与配体PD-Ls结合后，PD-1胞质区的免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)发生磷酸化，募集酪氨酸磷酸酶SHP-2[26]，进而使下游信号分子Lck介导的ZAP-70磷酸化作用减弱[27]，同时其阻断磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)激活，导致蛋白激酶B(AKT)活性降低，使PI3K-AKT-mTOR信号通路整体下调[28]，最终诱导CD8+T细胞和CD4+T细胞功能失活。另外PD-1也可通过RAS-EMK-ERK通路抑制相关蛋白激酶的活化来影响细胞增殖、分裂和分化。PD-1通过抑制PLC-γ1激活，进而影响RASGRP1的激活，最终破坏MEK-ERK激酶途径的激活[29]，使得T细胞失能或凋亡。除T细胞外，B细胞上的PD-1与PD-Ls结合后，通过募集包含SH2结构域的SHP-1和SHP-2使B细胞抗原受体邻近的信号分子Igα/β和Syk去磷酸化，减弱下游分子PLC-γ2、PI3K以及ERK的激活，从而传递免疫抑制信号[30](见图1)。

图1 PD-1/PD-Ls信号通路Fig 1 PD-1/PD-Ls signaling pathways

3.3 PD-1抑制剂作用位点PD-1抑制剂用于晚期HCC的治疗，主要是通过阻断PD-1/PD-Ls信号通路使T细胞活化上调，激活内源性抗肿瘤免疫反应。研究[31]表明，Nivolumab通过重链(VH)中3个CDR环和轻链(VL)中2个CDR环与PD-1相互作用阻断PD-1/PD-Ls信号通路，具体机制为PD-1结构中N环与Nivolumab VH的CDR1和CDR2环以氢键形式结合，另外PD-1的FG环还与Nivolumab VH的CDR3环以及VL的CDR2形成氢键，进而与PD-Ls竞争性结合PD-1，说明PD-1中的N环与Nivolumab的相互作用起主导作用。与Nivolumab不同，Pembrolizumab与PD-1相互作用的接触面有两个，第一个是Pembrolizumab的CDR环、结构域FR的β链和PD-1的C′D环相互作用，另一个是Pembrolizumab的CDR环和PD-1中C、C′、F链的残基相互作用，通过上述接触面间的相互作用阻断PD-1/PD-Ls信号通路[32]。最后竞争性结合分析发现，Nivolumab和Pembrolizumab在阻断PD-1/PD-Ls信号通路时存在部分互补性结合的作用[31]，这也为两者联合治疗肿瘤提供可能性。

4 总结与展望

综上所述，免疫治疗在恶性肿瘤的治疗中表现出巨大潜力，并且在晚期HCC的治疗中也初显成效。其中，PD-1抑制剂Nivolumab和Pembrolizumab的获批也有望延长晚期HCC患者的生存时间，提高患者缓解率，期待其未来在新的领域发挥重要作用。另外PD-1抑制剂、分子靶向药物、局部介入或消融的联合使用以及与晚期HCC相关新的免疫靶点的发现与识别，将为晚期HCC免疫生物治疗带来新的希望。