腹泻型肠易激综合征动物模型建立及评价

贺 星，刘 卫，唐 郡，朱 斌，李 超，郑 岩，崔立红

1.中国人民解放军联勤保障部队第九○一医院消化内科，安徽 合肥 230031； 2.中国人民解放军总医院第六医学中心消化内科

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的功能性肠病，其主要症状是反复出现的与腹痛相关的排便异常[1]。IBS的发病机制复杂多样，胃肠动力和感觉异常是其病理生理基础[2]，其发病与脑-肠轴功能改变有关[3]，是一种生物-心理-社会障碍，因此构建动物模型存在一定的困难。IBS的分型中腹泻型IBS(diarrhea-predominant IBS, IBS-D)最常见[4-5]，相关动物模型研究也最多[6]，但目前仍无法完整的复制该疾病，缺乏完美的IBS-D动物模型。本研究结合相关报道和课题组前期经验，采用急-慢性应激结合的方法构建IBS-D大鼠模型，通过精神和躯体双重应激改变大鼠的肠道动力和敏感性模拟IBS-D的发病，取得良好效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选择20只SPF级雌性Wistar大鼠为实验动物[7-8]，体质量(160±10)g，购自北京科宇动物养殖中心，平衡饲养3 d后用于实验。实验前1周使大鼠适应实验环境，大鼠均被安置在独立代谢笼内。实验过程中，除非特殊干预，一直供应大鼠标准饮食及自来水，温度控制在(22±2)℃，并保持12 h/12 h照明/黑暗节律。将20只大鼠采用随机数字法分为模型组和对照组，每组10只。模型组：接受急-慢应激法构建IBS-D大鼠模型，对照组：正常饲养，不接受任何干预及处理。

1.2 实验仪器及试剂光源实时控制仪(CHNT)；电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司，DH5000)；动脉夹(北京合理科创，DMJ-1.6)；水平振荡器(金坛市城西峥嵘实验仪器厂，SHZ-82)；电子天平(METTLER、TOLEOD)；大鼠固定器(北京搏贝科技有限公司，BB-500GB)；自制AWR阈值检测仪器(血压计、导尿管、灌胃针及无菌手套)；全封闭组织脱水机、组织包埋机型号、切片机、显微镜由我院病理科提供；10%水合氯醛(河北蓝梦生物科技有限公司)；2.5%戊二醛(北京天悦基因有限公司，200 ml)；二甲苯、石蜡、Ehrish苏木精、10%甲醛、伊红酒精染色剂、中性树胶等由我院病理科提供。

1.3 造模方法急-慢应激法[9]：给予Wistar大鼠以下刺激，夜间连续照明12 h，45 ℃闷热的环境中5 min(见图1A)，禁水24 h，4 ℃寒冷的环境中3 min(见图1B)，夹尾1 min(见图1C)，水平振动(120次/min)，40 min(见图1D)和食物剥夺24 h。每周按照随机顺序给予模型组上述刺激，每连续2 d给予的刺激顺序不能重复，避免大鼠能够预知刺激的发生，连续3周，然后休息1周。再给予纸带束缚前肩、前上肢、胸部，限制前上肢搔抓头面部，但不限制其活动(见图1E)，束缚时间为1 h。

图1 急-慢应激刺激图示 A：闷热刺激；B：冷刺激；C：夹尾应激；D：水平震荡；E：急性束缚应激； F： 避水应激Fig 1 Acute-chronic stress A: stuffy stimulation; B: cold environment; C: tail clamp; D: level vibration; E: acute restraint stress；F: water avoidance stress

1.4 检测指标

1.4.1 大鼠体质量：使用电子天平对两组大鼠进行称重并记录数值(g)。

1.4.2 蔗糖水摄入量[10]：在模型制备前，对所有大鼠进行1%蔗糖水摄入训练，训练方法：连续48 h给予大鼠自由摄入1%蔗糖水，然后24 h的禁水处理，最后测量1 h内1%蔗糖水摄入量(ml)。

1.4.3 1 h排便量：采用避水应激法[11]测量大鼠排便量(见图1F)。实验设备由透明有机玻璃容器(45 cm×25 cm×25 cm)和固体平台(10 cm×8 cm×8 cm)组成，平台置于玻璃容器底部，玻璃容器中装入室温水，高度为距离平台顶端1 cm，将大鼠置于平台上，使其对水产生心理应激反应，促进大鼠排便。观察记录其1 h排便粒数(干便)或次数(稀便)。于实验28～30 d连续记录5次数值，取平均值。

1.4.4 稀便率：通过滤纸印记判断湿便次数[9]，记录24 h内大便总次数、湿便次数，根据湿便次数及大便总次数计算稀便率。稀便率=湿便次数/大便总次数×100%。于造模后记录模型组、对照组大鼠稀便率。

1.4.5 肠道敏感性：采用检测大鼠腹部回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)压力阈值(mmHg)的方法检测大鼠肠道敏感性(见图2A)[12]。大鼠禁食12 h，不禁水。将大鼠置于固定器内，石蜡油润滑后将气囊插入肛门约6 cm，胶布固定防止滑脱。苏醒后适应20 min，血压计恒速向气囊注气加压，当大鼠出现腹部肌肉收缩(AWR评分2分)(见图2B)，此时压力为疼痛压力阈值[13]。

图2 AWR压力阈值检测方法(A)及AWR评分示意图(B)Fig 2 Detection method of AWR pressure threshold(A) and AWR score diagram(B)

1.4.6 HE染色观察结肠组织结构[14]：处死大鼠后，收集远端结肠，冲洗并固定在10%甲醛。然后经连续清洁和脱水处理结肠组织，并包埋在石蜡块中。最后将结肠组织切成薄片并进行标准HE染色。由病理科专业人员使用奥林巴斯光学显微镜放大40倍观察大鼠乙状结肠黏膜上皮的完整性，有无组织缺损、糜烂、水肿及溃疡。

2 结果

2.1 两组大鼠1 h排便量和湿便率比较造模后，比较两组大鼠1 h排便量，模型组(7.14±0.84)粒或次/h明显高于对照组(0.82±0.42)粒或次/h，差异有统计学意义(t=21.281，P=0.000)；模型组大鼠湿便率(12.15±0.85)%明显高于对照组(0)，差异有统计学意义(t=45.202，P=0.000)(见表1)。

表1 两组大鼠1 h排便量和湿便率比较Tab 1 Comparison of defecation number and wet feces rate between two groups of rats

2.2 两组大鼠造模前后疼痛压力阈值(AWR 2分)、糖水摄入量及体质量比较造模前，模型组与对照组大鼠疼痛压力阈值、蔗糖水摄入量及体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)；造模后，模型组大鼠疼痛压力阈值、蔗糖水摄入量及体质量明显低于对照组，差异有统计学意义(t=13.123，P=0.000；t=7.600，P=0.000；t=9.434，P=0.000)(见表2)。

表2 两组大鼠造模前后疼痛压力阈值、蔗糖水摄入量及体质量比较Tab 2 Comparison of pain pressure threshold, sucrose water intake and body weight between two groups of rats before and

2.3 两组大鼠肠道组织HE染色光镜下结果HE染色光镜下显示，两组大鼠结肠黏膜均未见明显水肿、糜烂、溃疡、出血，固有层内无中性粒细胞浸润，间质无明显水肿(见图3)。

图3 两组大鼠结肠黏膜光镜下表现(HE染色，40×) A: 对照组； B： 模型组Fig 3 Intestinal mucosal structure under light microscopy (HE staining,40×) A： control group; B: model group

3 讨论

IBS是一种常见的功能性肠病，在人体内的病理生理学尚不完全清楚，因此通过动物模型成功鉴定IBS症状改善的分子生物学基础，对于其临床前和转化研究十分重要[15]。目前研究常用的动物模型主要针对IBS-D，包括束缚应激模型、母婴分离、避水应激模型、多因素精神应激模型、结直肠扩张、感染后肠易激综合征(post-infectious IBS，PI-IBS)动物模型、理化刺激模型及转基因模型[16-19]，均从一定程度上构建出IBS-D的内脏敏感和动力异常特征，但仍无法完整复制疾病特点。本研究采用的应激方式涵盖睡眠、饮食、运动、感知及情绪方面，旨在通过反复中小强度的多因素刺激使大鼠通过“脑-肠轴”达到一种应激与适应相对平衡状态，即IBS-D状态，从而短暂模拟人类IBS-D患者病理生理。结果发现，通过28 d的慢性应激+1 d的急性应激后，所有大鼠均无死亡，模型组大鼠在排便次数、稀便率、蔗糖水摄入量、体质量、疼痛压力阈值等方面出现IBS-D样变化，效果明显且安全可行。

造模完成后，课题组首先分析两组大鼠1 h排便量和湿便率，对应IBS-D症状中的排便次数增加和稀便。本研究采用避水应激方法检测1 h排便量，可以模拟IBS-D在应激时排便增多的特点，主要反映大鼠的肠道动力和敏感性；采用的滤纸印迹法可以精确反应大鼠湿便次数，湿便率升高与肠道黏膜屏障功能障碍有关。研究发现，模型组大鼠1 h排便量和湿便率均高于对照组，该结果提示从症状角度，IBS-D大鼠模型构建成功。但本研究的IBS-D大鼠湿便率并未达到IBS-D定义的25%[20]，该结果考虑与本实验采用判断湿便的方法(滤纸印记)以及大鼠本身的生理特征有关。

其次，为了直观地观察大鼠肠道敏感性，本研究使用目前公认的AWR评分进行判断[21]。观察大鼠疼痛压力阈值，发现IBS-D大鼠AWR 2分压力阈值明显低于正常大鼠，提示IBS-D大鼠肠道敏感性低于正常大鼠，从肠道敏感性角度提示大鼠造模成功。

另外，为明确模型组大鼠情绪状态，课题组对两组大鼠的蔗糖水摄入量进行研究。蔗糖水摄入量是判断大鼠抑郁情绪的一种手段[9]，蔗糖水摄入量降低代表大鼠快感缺失。本实验结果显示，模型组大鼠蔗糖水摄入量明显低于对照组大鼠，提示模型组大鼠存在情绪障碍，体现出脑-肠轴在IBS-D发病中的作用。

本研究同时分析了大鼠的体质量动态变化，发现两组大鼠体质量均呈升高趋势，但受到应激刺激的大鼠体质量增长幅度较小，造模成功后体质量明显低于对照组，考虑与大鼠处于应激状态及排便量多有关。体质量方面的差异与人类IBS患者特点有所差异，原因可能大鼠是适应应激方面与灵长类动物尚存在差距，提示动物模型还有待完善。

本研究重点对两组大鼠显微结构进行了观察，结果通过40倍光镜下观察并未发现水肿、糜烂、溃疡、出血以及炎性细胞浸润，符合IBS-D肠道组织无器质性病变的特点[22]，从该角度分析造模成功。

综上所述，急-慢刺激后的大鼠在肠道症状、动力及感知、情绪障碍、显微结构方面与IBS-D发病特点一致，是一种安全有效的IBS-D造模方法。