思壮赤菇母种培养基优化研究

刘广平，刘 萱，贺晓龙，2，赵瑞华，2，刘月芹，高小朋，任桂梅

(1.延安大学生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心；3.陕西省红枣重点实验室；陕西延安716000)

思壮赤菇(Strophariarugosoannulata)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、球盖菇科、球盖菇属，是适合我国北方地区种植的一种珍稀食用菌。思壮赤菇菇形圆整、色泽艳丽，子实体中含有丰富的蛋白质、维生素以及矿物质等营养成分[1，2]，其鲜菇肉质细嫩，口感极好，享有“山林珍品”的美誉[3]。思壮赤菇具有非常广阔的种植利用前景：一是思壮赤菇可直接使用生料接种栽培，非常容易成活繁殖；二是思壮赤菇可在各种秸秆培养料(如稻草、麦秸、亚麻秆等)上生长，不仅能充分利用田间秸秆保护环境，其栽培后的菌渣废料还可直接作为肥料还田，增强土壤肥力[3]；三是思壮赤菇抗逆性强，生长繁殖的适应温度范围广，在5℃-30℃范围均可出菇[4]，便于于调整上市时间，可在其他蕈菌或蔬菜淡季时投放市场，满足广大消费者的需求。

目前国内外思壮赤菇的研究主要集中在培养基配方优化和栽培技术改良，而对其母种培养基的研究探索鲜见报道。众所周知，菌类母种是影响食用菌种植的关键因素，母种的质量水平直接决定了后续菌类种植的质量水平和产量高低[5]，思壮赤菇母种的优劣在很大程度上限制了后续的生产实践研究。因此，本研究对思壮赤菇母种培养基的配方进行了优化筛选，旨在选择适合思壮赤菇母种生长的培养基，为后续的生产实践研究提供支持和帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种、药品及试剂

思壮赤菇L-1由延安大学生命科学学院食用菌实验室提供。

葡萄糖、果糖、MgSO4、NH4Cl、NaNO3、KH2PO4、CaCl2、ZnSO4等均购自上海沪试，为国产分析纯。pH调节液：盐酸溶液、氢氧化钠溶液(0.1 mol/L)。

1.1.2 仪器设备

超净工作台(苏州安泰)。高压灭菌器(日本三洋)。电子天平(日本岛津)。超纯水机(美国密理博)。pH计(上海雷磁)。隔水式电热恒温培养箱(上海齐欣)。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制备

(1)基础培养基：200 g马铃薯去皮切块，煮沸后8层纱布过滤，滤液加18 g琼脂融化定容至1000 mL，30 min，121℃灭菌[6]。

(2)筛选碳源培养基：向基础培养基中分别加入葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉作为碳源，制成筛选碳源培养基，30 min，121℃灭菌。

(3)筛选氮源培养基：向基础培养基中分别加入蛋白胨和酵母膏2种有机氮及NH4Cl、NaNO3和KNO33种无机氮作氮源，制成筛选氮源培养基，30 min，121℃灭菌。

(4)筛选无机盐培养基：向基础培养基中分别加入MgSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2和ZnSO4等无机盐，制成筛选无机盐培养基，30 min，121℃灭菌[1，7-11]。

(5)对比培养基：以按正交试验的配方制备培养基，30 min，121℃灭菌。

1.2.2 pH筛选试验

灭菌后的基础培养基于无菌环境下倒入9 cm灭菌培养皿中，每个培养皿中装16 mL培养基，冷却后制成培养平板。将活化的思壮赤菇母种菌丝切成大小9 mm3的菌块，无菌条件下接种于培养平板中央。分别设pH 4、5、6、7、8、9、10等7个pH梯度，每个梯度设5个重复，23℃暗光培养。待接种块菌丝萌发生长时测量菌丝体长度，直至菌丝体长满培养皿表面，记录菌丝长度，计算生长速度。

1.2.3 碳源筛选试验

将各种灭菌后的碳源筛选培养基倒入9 cm灭菌培养皿制备培养平板，无菌条件下接入大小9 mm3活化的思壮赤菇菌块，每种碳源设5个重复，23℃暗光培养。确定最适碳源后再设置质量分数为0%、1%、2%、3%、4% 5个梯度接入9 mm3活化的思壮赤菇菌块，继续培养，记录菌丝长度，计算生长速度。

1.2.4 氮源筛选试验

将灭菌后的氮源筛选培养基倒入9 cm灭菌培养皿制备培养平板，无菌条件下接入大小9 mm3活化的思壮赤菇菌块，每种氮源设5个重复，23℃暗光培养。确定最适氮源后再设置质量分数为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 5个梯度接入9 mm3活化的思壮赤菇菌块继续培养，记录菌丝长度，计算生长速度。

1.2.5 无机盐筛选试验

将灭菌后的无机盐筛选培养基，倒入9 cm灭菌培养皿制备培养平板，无菌条件下接入大小9 mm3活化的思壮赤菇菌块，每种无机盐设5个重复，23℃暗光培养。确定最适无机盐后再设置质量分数为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 5个梯度接入9 mm3活化的思壮赤菇菌块继续培养，记录菌丝长度，计算生长速度。

1.2.6 思壮赤菇母种培养基配方的正交优化试验

在单因素试验筛选出适合思壮赤菇母种菌丝生长的最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐和最佳pH4个条件的基础上，以L9(34)进行正交试验，正交设计见表1。通过极差分析筛选影响菌丝生长的关键因素，结合菌丝生长状态分析最终确定适合思壮赤菇母种生长的最佳培养基配方。

表1 培养基配方正交试验方案

1.2.7 优化前后培养基菌丝生长情况比较

将活化的思壮赤菇菌丝切成9 mm3的菌块，无菌条件下接种于分别基础培养基和优化后的培养基上，23℃暗光培养，记录菌丝长度，比较二者的生长速度。

2 结果及分析

2.1 pH试验

思壮赤菇母种菌丝对pH适应范围比较广，但不同pH对菌丝生长有较大的影响。不同pH下菌丝的生长结果见图1。当pH为4时菌丝仅萌发而不伸长；pH<5时菌丝生长缓慢；pH为6-8时菌丝生长较快，生长速度超过3 mm/d。其中pH为7时菌丝生长速度达到最快，为3.61±0.16 mm/d，认为此时的pH是思壮赤菇菌丝生长的最合适pH。当pH>10时菌丝生长又会降低，而pH为11菌丝几乎不萌发。

2.2 碳源筛选结果

思壮赤菇对单糖的利用能力较好，在果糖培养基上生长速度为3.7±0.12 mm/d，葡萄糖培养基上生长速度为3.82±0.14 mm/d，所以葡萄糖可作为最佳碳源。而对双糖和多糖的利用能力较差，在以麦芽糖和可溶性淀粉为碳源的培养基上生长较为缓慢，在蔗糖碳源的培养基上菌丝长势极弱，生长速度仅为0.35±0.10 mm/d，结果如图2所示。

不同浓度葡萄糖影响思壮赤菇菌丝生长的结果见图3。培养基中无葡萄糖碳源，菌丝可以保持较低的基础生长，约为2.75±0.15 mm/d。随葡萄糖浓度升高，菌丝生长速度呈先升高后降低的趋势。在2%时达到顶峰，约为3.82±0.14 mm/d，而到4%时却降低到3.01±0.18 mm/d，所以2%是培养基中葡萄糖的最佳添加浓度。

2.3 氮源筛选结果

思壮赤菇的氮源比较广，但不同氮源培养基上，菌丝生长速度不同。总体看来，有机氮的供应效果优于无机氮，菌丝在有机氮源培养基上的生长速度快于无机氮源培养基。菌丝在蛋白胨和酵母膏为氮源的培养基上的生长速度分别为3.72±0.22 mm/d和3.48±0.15 mm/d，均超过无机氮源培养基中生长最快的硝酸钾氮源3.16±0.11 mm/d的速度(图4)，因此，选择蛋白胨作为思壮赤菇培养基的最适氮源。

思壮赤菇菌丝生长速度随培养基中蛋白胨浓度改变的结果见图5。随蛋白胨浓度逐渐升高，菌丝生长速度也慢慢增加，当蛋白胨浓度为0.3%，菌丝生长最快，然后又随蛋白胨浓度升高而降低，表明培养基中蛋白胨的最佳浓度为0.3%。

2.4 无机盐的筛选

无机盐对思壮赤菇的影响如图6所示，在MgSO4培养基上，思壮赤菇的生长速度达到3.61±0.12 mm/d，远高于在CaCl2、KH2PO4和NaCl培养基上的速度。同时发现，菌丝在ZnSO4培养基上几乎不能萌发生长，表明锌对菌丝生长有强烈的抑制作用，因此，将MgSO4添加到培养基中以调节离子强度。

当MgSO4浓度由0%高到0.3%时，思壮赤菇菌丝生长速度逐渐增加，在0.3%时到达最大值3.61±0.12 mm/d。而MgSO4浓度继续升高到0.4%时，菌丝的生长速度反而受到抑制，菌丝生长速度下降为3.16±0.15 mm/d。因此，选择0.3%为MgSO4添加的最适浓度(见图7)。

2.5 思壮赤菇母种培养基配方的优化

先通过4个单因素试验筛选出了适合思壮赤菇母种生长的最佳碳源葡萄糖、最佳氮源蛋白胨、最佳无机盐MgSO4和最佳pH为7的4个单因素，每个因素再分别取3个水平，并以L9(34)正交表进行正交试验[13，14]。表2为正交试验的优化试验及处理结果。

表2 优化培养条件正交试验结果及分析

由表2可以看出，配方7的菌丝生长速度最快，可达到4.86±0.12 mm/d；其次是配方6，达到4.01±0.14 mm/d；配方1和配方3生长速度最慢。通过极差分析表明4个因素对思壮赤菇母种菌丝长速影响大小顺序分别为：葡萄糖>pH>MgSO4>蛋白胨，碳源对思壮赤菇菌丝生长的影响最强，pH和无机盐次之，氮源的影响最小，结合菌丝生长浓密程度和洁白程度等指标得出思壮赤菇培养条件的最佳组合为A3B1C3D2，培养基配方为：葡萄糖2.5%、蛋白胨0.25%、MgSO40.35%、pH=7。

2.6 优化前后培养基菌丝生长情况比较结果

优化前菌丝体生长速度为3.61±0.16 mm/d，优化后菌丝体生长速度为4.86±0.12 mm/d，且优化后的培养基菌丝体浓密度和洁白度明显优于基础培养基的菌丝状态(见表3)，表明优化后的培养基明显优于优化前的基础培养基。

表3 优化前后培养基菌丝生长情况比较结果

注释：“+”表示菌丝洁白和浓密程度，越多表示菌丝生长越旺盛、活力越高。

3 讨论

本研究对思壮赤菇菌株的母种生长培养基的配方进行了优化研究。首先进行了碳源、氮源、无机盐和pH的4个单因素筛选，确定了适合此菌株母种生长的最佳碳源、最佳氮源、最佳无机盐和最佳pH，优化了各自的最合适浓度。其次进行了L9(34)水平的正交试验，通过极差分析筛选出对思壮赤菇母种生长有显著影响的因子，并综合菌丝长势得到适合思壮赤菇母种生长的较优组合。最后比较了配方优化前后培养基菌丝的生长情况，进一步证明优化后的培养基较优化前的培养基更适合菌株母种生长，最终确定思壮赤菇菌株母种培养基的最佳配方为土豆200 g，葡萄糖2.5%，蛋白胨0.25%，MgSO40.35%，琼脂18 g，水1000 mL，pH 7。

食用菌的培养目的不同，所需培养基的成分和比例也不尽相同，其成分的细微变化都将影响食用菌菌株的生长状态。本研究优化获得的思壮赤菇母种培养基对菌株母种的繁殖扩培具有指导意义。或许不能完全满足生产出菇的需要，因此，优化筛选适合规模化生产的最佳培养基还需后续试验进行深入研究。