提高温度对灵芝抗氧化活性的影响

刘月芹，高小朋，贺晓龙

(延安大学生命科学学院，陕西延安716000)

灵芝(Ganodermalucidum)，是我国一类传统药用真菌的统称，灵芝作为珍贵的中药材，在我国作为延年益寿和滋补身体之用，已有2000多年的历史，素有“仙草、瑞草”之美誉[1-3]。

诸多学者的研究证明，人体内产生的活性氧自由基及其反应会加速衰老及诱导各种生活习惯病，引发诸多慢性疾病[4]。而抗氧化剂能有效清除活性氧自由基，减缓人体衰老，预防疾病。目前，摄入外源性抗氧化剂是缓解氧化压力、预防多种疾病、提高机体的抗氧化能力的一种非常有效的措施，使得合成抗氧剂在医疗和食品领域越来越被大众所接受[5]。但是由于合成抗氧化剂对人体存在潜在危害，使合成抗氧化剂在食品和药物中的应用受到一定的限制，所以研究开发安全无毒副作用的天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂必将成为食药领域研究热点[6，7]。药用真菌不仅含有丰富的营养物质，还具有多种生理活性，是开发天然、高效、具有医疗保健功效的抗氧化食品或药品的最佳选择，具有较高的应用价值和广阔的市场前景[8]。

现代医学研究证实，灵芝具有非常丰富的药理活性，如调节免疫系统、通过增强宿主免疫调节达到抑肿瘤作用、促进体内生理代谢、通过提高氧化酶活性而清除体内自由基达到抗氧化、抗衰老、镇静、强心、降血糖血脂等[9]。灵芝的抗氧化能力主要体现在对羟自由基、超氧阴离子的清除能力上[10，11]。可见灵芝是开发天然、高效、具有医疗保健功效的抗氧化食品或药品的最佳选择[12]。

近年来，液体发酵技术以其具有周期短、易操作、成本低等优点，已广泛应用于大型食药用菌领域[13]。本论文参考了国内外对药用真菌液体发酵技术及其抗氧化活性方面的研究进展，进一步创新研究。因为灵芝属高温型菌类，生长温度范围较广，故本实验采用逐渐提高培养温度进行液体发酵，以抗坏血酸含量、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性为测定指标，对灵芝较高温度液体发酵过程中的抗氧化活性进行研究。探究提高温度液体发酵中灵芝抗氧化活性的变化规律，以期对灵芝作为天然抗氧化剂进一步开发利用有所助益。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和培养基

1.1.1 菌株

灵芝菌株(G.lucidumCGMCC 5.616)购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存于4℃冰箱PDA斜面培养基。

1.1.2 培养基

种子液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，去离子水1000 mL，pH 5.0。种子固体培养基：在种子液体培养基基础上添加琼脂20 g。液体发酵培养基：马铃薯200 g，葡萄糖25 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5g，维生素B 0.02 g，去离子水1000 mL，pH 5.0。

1.1.3 试剂

葡萄糖、无水硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂粉、AsA测定试剂盒、T-AOC测定试剂盒、SOD测定试剂盒、POD测定试剂盒和CAT测定试剂盒都购买于南京建成生物工程研究所。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器

超净工作台(苏州净化设备有限公司，VS-1300U)；紫外可见分光光度计(上海美谱达，UV-1200)；组合式光照振荡培养箱(上海知楚，ZQZY-BG)；超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司，DW-86L388)；恒温干燥箱(上海一恒，BPG-9156A)；恒温培养箱(上海一恒，DHP-9902)；恒温水浴锅(上海一恒，HWS-26)；高速冷冻离心机(德国艾本德，5424)。

1.2 方法

1.2.1 培养方案

采用静置与振荡相结合的分段培养方案。种子液的制备：保存于4℃斜面培养基上的灵芝菌株经活化后，重新保存于PDA平板培养皿中。然后用灭过菌的直径为1 cm的打孔器，对保存于培养皿中的灵芝母种进行取样，取灵芝母种4块接种于盛有100 mL发酵培养液的三角瓶(250 mL)中。26℃，150 r/min，避光振荡培养7 d。发酵培养：将上述得到的种子液按10%(v/v)的接种量接种于盛有150 mL发酵培养液的500 mL三角瓶中。先置于26℃下高速200 r/min先振荡培养1 d，然后将培养温度提高2℃达28℃培养至第3 d，此后每隔2 d将培养温度提高2℃，静置培养至第9 d，温度最后达到34℃。发酵培养期间，每隔2 d，每个温度下取样3瓶，培养液经12000 r/min离心10 min，取上清液，测定T-AOC、SOD、POD和CAT活性。留下的菌丝体经干燥后用于AsA含量的测定。

1.2.2 AsA含量测定

采用南京建成生物工程研究所AsA测定试剂盒。取干燥后的菌丝体0.1g，加试剂盒中的指定试剂研磨，离心取上清液。然后按照说明书将样品与各试剂旋涡混匀，37℃孵育30 min，后于波长536 nm，1 cm光径，比色，测定各管吸光度值，最后根据公式换算成抗坏血酸的含量。

1.2.3 SOD酶活测定

采用南京建成生物工程研究所T-SOD测定试剂盒进行，按照说明书将各试剂混匀，室温放置10 min，后于波长550 nm，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。定义：37℃每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位(U)。

1.2.4 CAT酶活测定

采用南京建成生物工程研究所CAT测定试剂盒。按照说明书将各试剂混匀，常温放置10 min，后于波长405 nm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。定义：37℃下，1 min内1.0 mL样品，能使反应体系的吸光度值每增加0.01所需的样品量为1个CAT单位(U)。

1.2.5 POD酶活测定

采用南京建成生物工程研究所POD测定试剂盒。按照说明书将各试剂混匀，常温放置10 min，后于波长420 nm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。定义：37℃下，1 min内1.0 mL样品，能使反应体系的吸光度值每增加0.01所需的样品量为1个POD单位(U)。

1.2.6 T-AOC测定

采用南京建成生物工程研究所T-AOC测定试剂盒。按照说明书将各试剂混匀，常温放置10 min，后于波长520 nm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。定义：37℃下，1 min内1.0 mL样品，能使反应体系的吸光度值每增加0.01所需的样品量，为1个总抗氧化能力单位(U)。

1.2.7 数据统计分析

所有重复实验的数据均用mean±SD表示。利用SPSS 15.0进行方差分析，多重比较不同温度下的显著性差异。P<0.05为有显著性差异；P<0.01为有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同温度培养阶段下的AsA含量

抗坏血酸(AscorbicAcid，AsA)又名维生素C，是一种自由基清除剂，可以很快地清除O-2，因此，抗坏血酸可以保护机体免受内源性氧自由基的损伤。本研究对不同温度发酵阶段下的AsA含量进行了测定。结果如下图1所示，研究发现，随着培养时间的延长，AsA含量整体上呈现先升高再降低的趋势，并在发酵的第7 d，发酵温度达到32℃时，AsA含量达到最大值为2.66±0.04 mg/100 g，比26℃和28℃下的AsA含量分别提高了1.11倍(P=0.01376)和42.25%(P=0.04163)，差异显著。30℃和34℃温度下，AsA含量在发酵的第5 d和第9 d分别达到2.45±0.08和2.32±0.06 mg/100 g，其值都低于32℃下的AsA含量，但分别比26℃下的AsA含量提高了94.44%和84.12%，显著性差异(P<0.05)。26℃和28℃下的AsA含量以及30℃、32℃和34℃下的AsA含量无显著性差异。结果表明在一定温度范围内，随着温度的逐步升高，AsA含量有显著的上升，但过高的温度(34℃以上)会导致灵芝细胞活力下降，消除活性氧自由基的能力也下降。

2.2 不同温度培养阶段下的SOD酶活

SOD是生物抗氧化酶类中的重点酶，是清除各种氧化物质的重要因素。SOD的作用机制为催化超氧化物的歧化反应，然后将超氧阴离子转化为H2O2，最后H2O2再被过氧化氢酶和其他氧化物酶转化为水分子，这样就达到了清除细胞内氧自由基、维持机体代谢平衡的重要目的[14]。不同温度培养阶段下的SOD酶活变化如图2所示：培养前3 d，SOD酶活变化不大，但第3 d后，SOD酶活呈现直线上升趋势。第7 d后，SOD酶活趋于平稳，在发酵的第9 d达到最高为47.02±1.26 U/mL，比26℃、28℃下的SOD酶活分别提高了75.84%和73.28%，差异显著(P<0.05)。30℃、32℃温度下的SOD酶活都低于34℃，但都比26℃、28℃下的SOD酶活有明显提高，且差异显著(P<0.05)。结果表明，随着培养时间的延长和培养温度的逐步提高，灵芝菌丝的生长性能受到影响，从而导致酶活的下降，但较高的培养温度确实提高了灵芝细胞内SOD的酶活，从而抵抗高温带来的氧化胁迫。

2.3 不同温度培养阶段下的CAT酶活

过氧化氢酶(CAT)也是抗氧化酶系统的重要组成部分，能催化过氧化氢分解成氧和水，能有效地清除细胞体内的活性氧自由基。通过逐步提高灵芝液体发酵温度，发现CAT酶活随着发酵温度的提高呈现先升高后下降的趋势，如图3所示：在发酵的前5 d，CAT酶活有所升高，但上升幅度不大。从第5 d开始，CAT酶活有个快速的上升趋势，在发酵的第7 d，发酵温度为32℃时，CAT酶活达到最大值为50.68±1.52 U/mL，比26℃﹑28℃和30℃下的CAT酶活分别提高了57.24%﹑47.93%和43.37%，差异显著(P<0.05)。在发酵的第9 d，发酵温度为34℃时，CAT酶活有所降低，但下降幅度不大，为46.97±1.03 U/mL。26℃﹑28℃和30℃下的CAT酶活以及32℃和34℃下的CAT酶活都无显著性差异(P>0.05)。结果表明，30℃～32℃温度范围内，有利于CAT酶活的提高，一定程度上提高了清除细胞体内活性氧的能力。

2.4 不同温度培养阶段下的POD酶活

过氧化物酶是由微生物所产生的一类氧化还原酶，主要功能是减轻过氧化氢对机体的伤害，其活性应激性变化被作为反映微生物受逆境胁迫的一个重要指标。结果发现，不同温度培养阶段下的POD酶活，整体上呈现先升高再降低的趋势，如图4所示，这一趋势和AsA含量变化一致。在发酵的第7 d和第9 d，POD酶活分别为1.87±0.04和1.68±0.05 U/mL，是26℃温度下的1.46倍和1.19倍，具有极其显著性差异(P<0.01)，比28℃﹑30℃下的POD酶活提高了40%以上，差异显著(P<0.05)。此外，30℃下的POD酶活也比26℃下的提高了59.12%，差异显著。结果表明，适当的提高培养温度，尤其是30℃～32℃温度范围内，能有效激活并提高了灵芝细胞内POD酶活，更好地抵抗高温带来的氧化胁迫。

2.5 不同温度培养阶段下的总抗氧化能力比较

抗氧化能力是指物质对机体内各种氧化物质的清除能力[15]。逐渐提高液体培养温度，9 d内灵芝的总抗氧化能力变化如图5所示。随着培养时间的延长和温度的不断提高，T-AOC呈现先升高再降低的趋势，在发酵的第5 d(30℃)、第7 d(32℃)和第9 d(34℃)，T-AOC值分别为65.12±2.65、87.16±4.27和73.29±3.11 U/mL，虽然3个温度下的T-AOC值无显著性差异，但却是26℃和28℃下的2倍多，有极其显著性差异(P<0.01)。28℃下的T-AOC值高于26℃下的，但2个温度下的T-AOC值并无显著性差异(P>0.05)。结果表明，随着温度的提高，灵芝总抗氧化能力有一定的提高，灵芝细胞体内清除各种氧化物质的能力加强，以适应高温的刺激。

3 讨论

温度是影响微生物生长发育的重要环境因素，高温培养条件下，微生物细胞体内会产生大量的活性氧自由基，严重影响细胞的活力。为抵抗高温胁迫，微生物细胞会启动体内的抗氧化系统以消除自由基[16]。研究表明灵芝是药用真菌，具有很强的抗氧化作用[17，18]。虽然也有通过培养条件的优化提高了灵芝的抗氧化性，但高温条件下对灵芝抗氧化性能影响的考察很少[12]。鉴于此，本实验采用液体发酵技术，逐级提高发酵温度，来探究高温对灵芝液体发酵过程中抗氧化活性的影响，为灵芝作为天然安全高效的抗氧化剂来进一步开发利用的可行性进行探究与评价。

通过本文的研究发现，除了SOD酶活随着培养温度的升高而上升外，灵芝发酵液中的AsA含量、CAT、POD和T-AOC活性整体上呈现先升高再下降的趋势，且都在发酵温度为32℃，发酵时间为第7 d时达到最大值，比26℃温度下的AsA含量、CAT、POD和T-AOC活性分别提高了1.11倍﹑57.24%﹑1.46倍和4.19倍。微生物细胞内的酶系一般需要在较高的温度下才能发挥到最佳酶活，这一温度多半情况下是高于微生物的最适生长温度的。有研究表明随着培养温度的升高，灵芝的漆酶和纤维素酶的酶活也不断提高，较高的温度有利于酶的分泌[19-21]。我们的结果表明在整个发酵期间，较高的发酵温度提高了灵芝抗氧化酶的酶活。虽然高温引起灵芝细胞内高浓度的活性氧自由基，但是高温同时也激活并提高了抗氧化酶系的活性，有效地抵抗了高温胁迫。

研究证实，在液体培养条件下，温度对灵芝抗氧化系统有显著的影响，较高的温度提高了灵芝抗氧化能力。这为灵芝作为天然抗氧化剂开发利用提供了新的思路和方法，有较好的理论依据和参考价值。