HIV检测方法的应用研究进展

谌章舟， 杨细凤，李仲娟，王小琴，游细玉*

(1.湖北理工学院 a.医学院, b.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室,湖北 黄石 435003； 2.湖北华润武钢总医院 检验科，湖北 武汉 430080)

《中国艾滋病毒治疗指南(2018版)》建议，为保护患者的免疫系统，控制艾滋病病毒(HIV)在患者体内复制，减少进一步传播，应在所有艾滋病毒感染者中启动抗逆转录病毒(ART)治疗。相应地，这要求提供高质量的HIV诊断检测，以识别HIV感染，监测抗逆转录病毒治疗的有效性，并及时评估HIV/AIDS的控制效果及其在个人和群体层面出现的耐药性[1]。因此，艾滋病病毒诊断对实现流行控制至关重要，需要将传统的基于实验室的诊断检测和新技术相结合，以扩大覆盖面、提高检测率。

一般情况下，个人在感染HIV后的临床症状和生物学特征分为3个主要阶段。第1阶段为急性期，以病毒在体内迅速增殖和传播为特征，多发生在感染后第2～4周。在这一阶段，病毒复制爆发，血液中的p24抗原(Ag)脱落并达到峰值。第2阶段是慢性或无症状期，在此阶段，病毒继续繁殖，但水平较低。宿主免疫系统也开始产生抗体(Ab)，同时病毒载量(Viral Load,VL)下降到稳定状态。随着VL下降，p24抗原水平也下降。这是由于p24抗原与抗体结合形成抗体-p24抗原复合物，从而降低血液中游离p24抗原的水平[2]。从感染到出现抗体(血清转化)的这段时间被称为“窗口期”。如果患者不接受治疗，随着病毒继续复制，作为病毒复制宿主靶细胞的CD4细胞会逐渐被破坏，导致CD4细胞数量下降。第3个阶段为艾滋病阶段，随着病毒不断复制和CD4细胞消耗，宿主免疫系统被削弱。这3个阶段出现的HIV RNA、p24抗原、HIV抗体和CD4细胞的生物标记在实验室诊断艾滋病病毒中的应用包括：①抗体检测(确定个体血清状态)；②p24抗原抗体检测和病毒载量定量(区分短期和长期感染)；③RNA和DNA检测(用于婴儿早期诊断，EID)；④CD4细胞的检测(疾病进展阶段的监测)；⑤病毒载量测定(鉴定和监测HIV/AIDS的治疗效果)；⑥RNA和DNA检测基因的耐药突变情况(鉴定抗逆转录病毒治疗有效性)。

1 血清学诊断平台的研究进展

1.1 酶免疫测定法

目前，酶免疫测定(Enzyme immunoassays, EIA)方法已经发展到了第5代。第1代方法是使用从HIV阳性培养的整个病毒裂解物中提取的抗原来检测IgG抗体。该抗原裂解液中存在大量杂质，测定特异性较低，假阳性率极高。随后，免疫荧光(IFA)等特异性较高的验证性试验被引入，以消除假阳性[3]。第2代检测方法是使用从HIV-1蛋白的免疫优势区(IDR)和HIV-2的gp36中获得的合成肽或重组蛋白来增加敏感性和减少假阳性。第3代检测是使用三明治形式和多种抗原在血清中捕获HIV-1和HIV-2抗体，包括HIV-1中的膜蛋白p24与gp160，以及HIV-2中的膜蛋白gp36、IDR的重组肽、合成肽等。除了IgG外，第3代检测还发现了早期HIV-1 IgM抗体，进一步缩短了“窗口期”[4]。第4代是EIAs，使用全自动化学发光微粒子技术，同时检测HIV-1 p24抗原、HIV-1(M，N，O组)和HIV-2的抗体。HIV Ag/Ab联合检测p24抗原缩短了“窗口期”，增加了早期发现HIV感染的机会。这种检测仪器提供随机存取功能，无标本测试延迟现象，且能在30 min内出结果，检测样本量达150个/h，最适合处理大样本量的检测和血库筛查试验，但无法单独区分检测到的p24抗原和HIV-1/2抗体。第5代EIAs，如Bio-Rad BioPlex 2200 HIV Ag-Ab分析，使用了多套磁珠。这些磁珠表面涂有针对HIV-1 (M，N，O组)和HIV-2的p24单克隆抗体和表位，可作为进一步预防艾滋病毒传播的早期干预措施。在“窗口期”感染p24抗原的急性感染者可通过单一检测确定，感染HIV-1或HIV-2的个体也可被确认。

1.2 免疫印迹试验

尽管酶联免疫筛选技术在特异性和高敏感性方面取得了长足进展，但仍存在假阳性的问题。因此，在患者开始进行抗逆转录病毒治疗之前，需要对最初的酶联免疫试验标本进行补充检测，以确认艾滋病毒感染。常用的辅助试验是免疫印迹试验(Western blotting,WB)，即使用梯度纯化的HIV裂解液电泳，并将电泳条带转移到硝化纤维条带上进行WB测定。在WB上运行的标本被认为是阳性的，其必须包含对p24抗原反应的抗体和一个或多个针对包膜糖蛋白的抗体(gp160/gp120和/或gp41)[5]。

2 HIV快速检测平台的研究进展

2.1 HIV快速检测

HIV快速检测在20世纪90年代初开始使用，用于在进行外科手术和器官移植之前及产妇分娩之前迅速确定患者血清状态。其优势在于初级卫生保健中心的非实验室工作人员也可以为居住在偏远地区的患者提供诊断服务。开发的第1个HIV快速检测方法是微基因凝集试验和Abbott Murex单次使用诊断系统[6]。这些早期艾滋病毒快速检测的一个主要问题是具有相当高的假阳性和假阴性结果率。随后，使用不同的检测平台，如侧流装置(测定HIV-1/2、Unigold、StatPak和OraQuick Advance HIV-1/2)、流式细胞仪(Insti HIV-1/2)和改良的凝集测定，极大地简化和改进了检测程序，提高了检测敏感性和特异性。这些检测平台能在30 min内完成检测，因此非常适合在初级卫生保健站点和流动诊所进行检测和咨询。Insti HIV-1/2检测只需1 min，其准确性也比较高。非实验室工作人员也可以通过标准的培训进行最快速的检测。OraQuick Advance HIV-1/2快速检测等检测方法使用口腔液替代手指穿刺全血的样本类型，用于提供个体的HIV血清状态[7]。

2.2 HIV自我检测平台

HIV自我检测是一种创新方法，可用于接触HIV感染高危人群的检测，允许个人收集自己的样本(口腔液或全血)进行HIV测试。世界卫生组织对HIV快速检测手段进行了资格预审，分别是使用全血作为样本的Autotest VIH和Insti HIV-1/2抗体检测，使用口腔液的OraQuick Advance HIV-1/2抗体快速检测[8]。同样，美国FDA批准了VIH和Insti的全血HIV-1/2抗体测试和OraQuick Advance的口腔液HIV-1/2抗体测试。用户可以在药店购买艾滋病毒自我测试试剂盒，用刺血针刺手指进行测试，按照提供的解释结果说明判断是否感染。若测试无任何反应，但已知最近接触过艾滋病毒或处于感染高风险的个人应在6周后重复自我检测，以排除处于“窗口期”的可能性。

3 抗体亲和力检测平台的研究进展

抗体的亲和力(抗体的结合强度)大小被认为是试验是否可靠的标志。成熟的抗体已被用来识别和区分许多病毒的近期感染(低抗体亲和)和长期感染(高抗体亲和)。早期，使用不同的解离试剂对商业性HIV检测试验(如测定抗体亲和指数)进行了改造，虽然提供了一些有用信息，但限制了抗原的使用，还需要自动化的平台(如Abbott Axsym或Architect)来计算亲和度指数。为了解决抗原的多样性问题，一种新型的单孔亲和度测定方法被采用。其使用一定量抗原的孔来进行检测，限制抗原的数量，迫使二价抗体以单价结合，从而在一个孔内分离近期感染(弱抗体)和长期感染(强抗体)。有限抗原亲和度EIA的效果比测定抗体亲和度指数的双孔试验更好，并已运用到商业试剂盒的开发中[9]。

4 病毒载量的检测和定量平台的研究进展

在《使用抗逆转录病毒药物治疗和预防艾滋病毒感染的综合指南》(2013版)中，世界卫生组织强烈建议在监测抗逆转录病毒和确认治疗效果时使用病毒载量(VL)检测。与免疫学和临床监测标记相比，VL检测是ART成功的准确记录。在确定HIV载量的检测中，最早是通过定量培养外周血单核细胞或血浆来测量VL，该方法为劳动密集型，缺乏可重复性。自1996年首次使用PCR技术分析VL以来，已研发出几种商业分析方法。病毒载量检测法已经被美国FDA批准，并获得WHO认可。在早期阶段，该方法会出现假阳性，而且在同样的测量中会有较大的VL数据差异。然而，通过使用污染控制策略、内部校准控制、过程自动化和实时检测技术，病毒载量测定法得到了很大的改进。随着所有制造商采用一套通用的已知VL标准，VL测定标准化成为可能。制造商还利用收集的临床标本检验分析敏感性和特异性[10]。血浆中HIV-1 VL的定量被标准化，并表示为每毫升血浆中HIV-1 RNA拷贝数[11]。

根据放大原理，病毒载量检测试验可分为3组检测。第1组是使用逆转录PCR (RT-PCR)逆转录HIV病毒RNA为cDNA的检测。使用RT-PCR的检测包括Abbott RealTime HIV-1 PCR、Beckman Coulter DXN Veris HIV-1检测、生物中心通用型HIV-1病毒载量检测、Cepheid GeneXpert HIV-1病毒载量检测、Roche Cobas CAP/CTM HIV-1病毒载量检测和Siemens Versant HIV-1 RNA1.5。第2组采用bioMerieux NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0检测和Hologic Aptima HIV-1定量检测，使用T7 RNA聚合酶进行扩增。第3组采用 HIV-1 RNA 3.0 (bDNA[DNA])检测，采用信号扩增方法。但该检测方法也有缺点，如遗传多样性可能对病毒的定量检测构成挑战。大多数VL检测是基于PCR扩增和来自HIV基因组保守区域的引物/探针的杂交。然而，在引物的3’端存在1个或2个核苷酸取代，就可能导致VL被低估100多倍。早期版本的VL测试主要是基于B亚型病毒开发的，通常在非B亚型病毒的测试中失败。目前，大多数的检测方法都是针对HIV-1组M亚型(A至H亚型)多个保守区域的引物/探针和循环重组形式进行改进。由于遗传多样性可以显著影响VL的测定，因此检测人员必须能够识别异常的VL测定，同时能够比较不同VL检测试剂盒的检测结果，并正确量化该检测结果[12]。

5 HIV耐药性检测平台的研究进展

5.1 表型及基因型检测方法

HIV耐药性(Drug resisitance, DR)监测可通过表型或基因型检测方法实现[13]。表型分析是在体外进行的，并在细胞培养中测量HIV对抗逆转录病毒(Antiretrovirals，ARVs)的敏感性，将HIV基因50%复制抑制率所需的ARV浓度作为基本评价单位，即为[IC50]。由于表型分析方案的复杂性，它们通常被推荐用于已知或怀疑有复杂DR突变模式的人，特别是对蛋白酶抑制剂耐药的人。本试验需要3 mL血浆，VL最低为500拷贝数/mL,2～4周即可出报告，价格便宜。基因型检测则是包括对HIV基因组的蛋白酶、逆转录酶或整合酶区域的测序，以及识别对ARVs具有临床意义的耐药突变[14]。在美国，基因型检测被推荐为耐药检测的首选方法，也是标准HIV护理和管理的一个组成部分，但由于其高昂的成本及对实验室基础设施和检测人员分析技能的高要求，对于大多数贫穷国家是难以承受的。

5.2 基因分型方法

基因分型方法有3种基本类型。①基于Sanger的测序。以HIV-1基因组的蛋白酶、逆转录酶或整合酶编码序列为目标，采用传统的Sanger测序原理，即DNA聚合酶在体外复制过程中将链终止的二脱氧核苷酸选择性结合。最常用的商业测定是美国FDA批准的Trugene和ViroSeq测定。试剂盒的价格昂贵，主要用于血浆标本或外围单核细胞检测[15]。②深度测序。目前，有3种不同类型的深度测序仪器被用于深度测序，包括Illumina MiSeq、罗氏454/GS初级测序仪和离子PGM 200测序仪。这些仪器的操作原理相似，可在1～2 d内完成耐药性报告[16]。耐药相关基因用患者特异性的引物进行扩增，并且可同时将96名患者的扩增产物集中在一次深度测序试验中，从而大大降低操作成本。由于扩增的病毒序列具有克隆性，检测微小变异的灵敏度可由桑格法的20%提高到1%～5%[17]。Sanger测序和深度测序分析都要求对单个样本进行常规测序或对汇集样本进行新一代高通量测序。这些分析应用程序的一个基本要求是建立一个复杂的高维护性分子实验室，配备DNA测序仪和高技能的实验人员。③ 等位多通道特异性等位基因测定(Multiplex allele-specific,MAS)。该方法不需要使用测序仪。例如,多通路复用基因特异性阵列分析优化了20个耐药性位点B亚型。C-specific MAS耐药性试验优化了耐药性样本，并取得了比较好的效果。耐药性检测结果主要与Sanger测序法生成的数据序列对比,由罗氏454 GS-based深度测序验证[18]。等位基因特异性鉴别检测的结果很容易解释。如果对特定国家或地区的已知循环病毒进行优化，该检测可以快速产生耐药性监测数据，从而为国家或地区的抗逆转录病毒治疗政策提供信息。

6 CD4细胞检测平台的研究进展

CD4细胞计数已成为艾滋病毒感染患者护理的关键参考指标，是指导患者开始抗逆转录病毒治疗和监测治疗效果的主要实验室检测方法。研究人员开发了CD4 T细胞流式细胞术，作为识别和监测HIV感染患者的临床实验室测试。流式细胞术允许使用光散射技术对单个细胞进行定量分析，以确定细胞的大小和内部的复杂性，并使用激光激发与细胞成分结合的荧光色素来识别特异性修饰的目标细胞。最早的CD4检测采用了双平台方法，使用流式细胞仪确定CD4 T细胞的百分比，使用血液学分析仪提供总淋巴细胞数，用这2个值来计算CD4 T细胞的绝对计数[19]。体积流式细胞术通过流式细胞和基于珠粒的计数(即流式细胞术)提供精确的样品体积(在每个样本中加入已知浓度的荧光珠)，可以在一台仪器上测定CD4百分比和CD4绝对计数，从而降低结果的处理复杂性和可变性[20]。

Becton Dickinson (BD) FACS计数系统于1994年发布，是第一个专门用于临床CD4细胞计数的仪器，是一个单独使用BD试剂的封闭系统，是一种彩色流式细胞仪，与流式细胞仪计数试剂盒一起用于测量CD4、CD3和CD8细胞计数。其他试剂，如BD流式细胞仪计数CD4试剂，可用于测量CD4百分比和CD4细胞的绝对计数。因具有自动选通道和预先测量的试剂管，FACS计数系统操作比较方便。但其局限在于相对较低的吞吐量，每天只能分析30～80个标本[21]。2015年，Beckman Coulter推出的aquos CL仪器作为第一款“加载-运行”式的细胞仪被推向市场。这是一个完全自动化的大型台式细胞仪，减少了实验室人员的操作时间。所有的试剂在仪器上都有条形码，还有专门的质量控制材料。在仪器上对这些材料进行分析，如果超出范围或过期就标记出来。Beckman Coulter Aquios CL仪器代表了临床流式细胞仪的一个新时代，可以自动处理标本，并跟踪质量控制的有效性和试剂的货架期。

7 结束语

在过去的30多年里，HIV诊断学技术不断发展，HIV分子检测的出现缩短了“窗口期”，并从最初主要基于艾滋病毒B亚型的设计发展到包括非B亚型，以克服HIV遗传多样性的障碍。除了解决HIV遗传多样性之外，还改进了检测方法，避免误诊、漏诊，提高了检测率，并不断改变指导方针，以便在更好地了解艾滋病疫情的情况下，提高患者护理的质量。HIV快速检测诊断，能及时在抗逆转录病毒治疗中确定HIV状态和病毒治疗效果，在人类与HIV/AIDS的斗争中发挥了关键作用。