PFKFB3敲减抑制肺腺癌细胞A549增殖和转移

王希方，雷 雨，刘 屹，岳青芳，侯银银，曹 菲，孙 超，王海鹏，陆王锋

(1.陕西省人民医院肿瘤内科，西安 710068；2.商洛市中心医院胃肠外科，陕西 商洛，726000)

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因。肺腺癌约占非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的80%，已成为最常见的亚型[1-2]。肺腺癌发病率呈快速上升趋势，且其发病机制至今仍不清楚[3-4]。因此，对引起肺腺癌患者癌变的相关分子机制进行广泛的研究十分必要。6-磷酸果糖-2-激酶/2-果糖-2,6-双磷酸酶(PFKFBs)为一双功能酶，具有激酶和磷酸酶活性，可因不同的基因编码4个不同的PFKFBs(PFKFB1,PFKFB2,PFKFB3,PFKFB4)，且酶的活性和组织表达谱完全不同[5]。在PFKFBs成员中，PFKFB3的激酶活性更高，双磷酸酶活性更低。这增加了果糖2,6-二磷酸(F2,6BP)的产量，在正常和病理生理条件下严格控制糖酵解速率[6-7]。既往研究[8]发现PFKFB3在不同器官和肿瘤细胞中广泛表达，如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌等，它会引起新陈代谢的改变，导致肿瘤细胞的增殖和存活。PFKFB3具有类似于癌基因的调控元件，且PFKFB3的高表达是肺腺癌患者总体生存期较差的独立预后标志物[9]。本研究通过敲减肺腺癌细胞A549中PFKFB3，与未敲减的A549细胞比较细胞活力、细胞周期、细胞转移，探讨PFKFB3敲减对肺腺癌细胞A549增殖和转移的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

人肺腺癌细胞系A549细胞购自美国典型培养物保藏中心。Lipofectamine TM 2000以及逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，PCR引物序列由浙江格鲁斯特生物科技公司合成。基础培养基和胎牛血清(美国Biological Industries)，si-PFKFB3 1/2(美国Sigma公司)，青霉素和链霉素(上海艾研生物科技有限公司)，酶标仪(美国BD公司)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国生物工程有限公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗和羊抗兔IgG二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养与转染

将A549细胞置于添加青霉素100 U·mL-1和链霉素100 μg·mL-1的含15%胎牛血清1640培养液中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育。细胞生长覆盖瓶底时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，平均1～2 d传代1次。选取对数生长期的A549细胞经胰酶消化后，用基础培养基调整细胞密度为1×106mL-1，将细胞接种到6孔板后37 ℃孵育24 h，按照制造商说明书分别使用si-PFKFB3#1、si-PFKFB3#2以及si-ctrl转染细胞，并检测转染效率。质粒si-PFKFB3#1(5’-AGCCCGGATTACAAAGACTGC-3’)、si-PFKFB3#2(5’-GGTAGCTGGCTTCATAGC’)及对照质粒si-ctrl购自美国Sigma公司。

1.3 MTT检测细胞活力

取对数生长期转染24 h后的A549细胞，调整细胞密度以5×103·孔-1接种96孔板内，于5%CO2、37 ℃分别孵育24、48、72、96 h后，每孔分别加入20 μL MTT液(5 mg·mL-1)，继续培养4 h。终止培养，以500×g离心3 min，弃上清，按照试剂盒说明书使用细胞增殖试剂盒Ⅱ(MTT，Roche，德国)评估细胞增殖，用全自动酶标仪于490 nm处测定并记录各孔吸光值(A值)，参比波长为630 nm。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测细胞周期

取转染24 h后A549细胞，按1×106mL-1接种24孔板内，放入37 ℃、5%CO2、湿度100%的培养箱中培养48 h，收集各组细胞，弃上清，遇冷PBS洗涤2次，吸去PBS，加入预冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。1500 r·min-1离心5 min，弃上清，以3 mL的PBS洗涤3次，按Muse Annexin V、Cell Cycle试剂盒(美国Millipore&Billerica公司)说明书操作，加入Annexin V结合液重悬细胞，吹打均匀，使细胞密度约为1×108L-1，移至流式管中再加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混匀，置于4 ℃避光孵育15 min后，加入10 μL PI染色液混匀，置于4 ℃避光孵育5 min，然后使用荧光激活细胞分选FACS Array生物分析仪(美国Biosciences公司)检测细胞周期。

1.5 transwell检测细胞转移能力

1.6 western-bolt(WB)检测PFKFB3蛋白表达

取转染24 h后A549细胞，以5×103L-1的密度接种，弃培养基，胰酶消化，离心收集细胞，使用PBS稀释40 μg总蛋白后(1:1000)，加入上样缓冲液，将其混合并置于95 ℃水浴锅中水浴5 min加热变性后进行上样，配制Mini-PROTEAN TGX凝胶(25%，美国CST公司)，80 V恒压下蛋白电泳至分离胶与浓缩胶界面时换为120 V电压，然后在含15%甲醇的Tris-甘氨酸缓冲液中平衡10 min，35 V下转移到PVDF膜上(美国Billerica公司)。在含5%脱脂牛奶的TBS中室温封闭1 h，然后与PFKFB3一抗4 ℃孵育过夜。用TBST清洗PVDF膜4次后与IgG二抗室温孵育2 h。TBST洗涤去除多余抗体后加入化学发光试剂ECL进行显影。GAPDH用作内参，用Image J软件进行相应条带的蛋白水平分析。实验重复3次。

1.7 统计学方法

实验数据用SPSS19.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用ANOVA方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PFKFB3敲减效率检测

在A549细胞中转染2种敲减PFKFB3序列的质粒，采用WB检测PFKFB3敲减效率，结果发现，与si-ctrl组比较，si-PFKFB3#1组和si-PFKFB3#2组PFKFB3/GAPDH蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，见图1和表1。

表1 WB检测PFKFB3敲减效率定量结果

2.2 PFKFB3敲减抑制肺腺癌细胞A549增殖

MTT检测各组细胞活力，孵育48、72和96 h，与si-ctrl组相同时间点比较，si-PFKFB3#1组和si-PFKFB3#2组细胞活力降低，抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组不同时间点490 nm的平均A值及抑制率比较

2.3 PFKFB3敲减引起肺腺癌细胞A549阻滞在G1期

流式细胞术检测各组细胞周期，结果发现，与si-ctrl组比较，si-PFKFB3#1组和si-PFKFB3#2组细胞G1期比例增加，S期比例减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3和图2。

表3 各组细胞周期占比比较

2.4 PFKFB3敲减抑制肺腺癌细胞A549转移

transwell检测各组细胞转移能力，结果发现，与si-ctrl组(305±27)比较，si-PFKFB3#1组(125±20)和si-PFKFB3#2组(136±18)转移细胞数显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3 讨论

肺癌在癌症中发病率和病死率位居第一，根据组织学分类，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，约占所有肺癌病例的80%，肺腺癌已成为最常见的亚型，占非小细胞肺癌病例的75%[10]。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现，表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但腺癌具有高度浸润和破坏性生长特征，易侵犯血管，因此极易发生转移，预后较差。近年来，肺癌的治疗取得了许多进展，但非小细胞肺癌的预后至今未见明显改善。即使进行手术辅以放化疗，肺癌患者的5年生存率也未超过30%[11]。以往的研究[12]发现：肺腺癌比肺鳞癌(squamous cell lung carcinoma，SqCC)更容易生长和扩散，然而肺腺癌发生发展的分子机制至今仍不清楚。因此，通过识别新的肺腺癌生物标志物，能准确识别肺腺癌的生物学特征，将有助于肺腺癌的诊断、治疗和预后，并提供可靠的理论支持。

在PFKFBs家族的4种亚型中，PFKFB3亚型最为重要，因为它功能最为强大。有研究[13]显示，肿瘤组织中的PFKFB3 mRNA和蛋白水平明显高于正常组织。最近的研究[14-15]表明，激活PFKFB3分子相关通路能够抑制T24细胞PD-L1分子的表达并能够增强膀胱癌细胞的增殖和迁移能力；PFKFB3在乳腺癌组织中高表达，且与肿瘤的侵袭和转移密切相关,其高表达提示乳腺癌患者预后不良。虽然科学家们一直未能完全阐明PFKFB3在人类癌症细胞高表达的确切机制，但是已经证明HIF-1α促进PFKFB3 mRNA在人类癌症细胞的转录[5,16]。且敲除PFKFB3基因可以降低癌细胞的葡萄糖代谢，进而抑制癌细胞的进展。因此，该酶有望成为肿瘤抗癌治疗的靶点。近年来，随着RNA干扰技术的进展，已广泛应用于致癌基因的抑制研究[17]。以往的研究[5]证明PFKFB3在加速糖酵解、血管生成和肿瘤进展中起重要作用。且肿瘤细胞即使处在正常氧含量的状态下，也会以增加糖酵解的方式来增加能量供应。有研究[18]报道PFKFB3通过参与糖酵解影响葡萄糖代谢，或者在阻断PFKFB3的作用时，通过使肿瘤组织的血管正常化来减少癌细胞的侵袭、血管内渗和转移。此外，PFKFB3对胃癌的细胞周期、凋亡、肿瘤生长和侵袭性有显著的控制作用[19-20]。通过抑制PFKFB3的表达可以将细胞周期停留在G1期，抑制细胞增殖，进而实现癌细胞的凋亡。

本研究通过在A549细胞中转染2种敲减PFKFB3序列的质粒证明，si-PFKFB3#1组和si-PFKFB3#2组PFKFB3/GAPDH蛋白相对表达量显著降低；细胞活力降低；A549细胞阻滞在G1期；抑制肺腺癌细胞A549转移。近年来研究[21]证实，PFKFB3过表达，可增加糖酵解、加快血管生成和肿瘤进展。本研究敲减PFKFB3，其蛋白表达量降低，细胞增殖、转移能力下降，进而抑制肺腺癌进展，其与上述研究相符。这可能与降低其糖酵解，减少能量供应，且促进肿瘤血管正常化，进而抑制了细胞增殖、转移[22]有关。

综上所述，敲减PFKFB3，可显著降低PFKFB3/GAPDH蛋白的表达，抑制肺腺癌A549细胞增殖和转移。提示PFKFB3是一种有前途的抗肿瘤靶向位点，对于肺腺癌的治疗有较大的意义，为其药物的开发提供了理论依据。