龚绍慧,鄢腾峰,吕世刚,叶敏华,吴淼经,祝新根
(南昌大学第二附属医院神经外科,南昌 330006)
胶质瘤常见于成年人,是中枢神经系统最为恶性的原发性肿瘤[1]。在过去的10年中,胶质瘤的治疗方式主要是手术治疗和联合放化疗[2]。随着分子生物学的发展,对胶质瘤发病机制得到了进一步的认识,在胶质瘤的分子研究中已描述了几种遗传和表观遗传学的改变[3-4]。因此,探索更多新的潜在分子机制对于胶质瘤的分子治疗有着重要意义。本研究探讨miR-586对胶质瘤细胞增殖及细胞周期的影响。
人脑组织标本包括6例非肿瘤脑组织和30例胶质母细胞瘤脑组织标本,均来自南昌大学第二附属医院神经外科,经患者及家属知情并签署知情同意书后,将标本留取并放在液氮罐中冻存。本研究经本院医学伦理学委员会同意。
1.2.1 细胞培养、转染及分组
取出在液氮中冻存的胶质瘤细胞及人正常星形胶质细胞,用含10%血清的培养基于37 ℃、5%CO2的孵育箱中培养,当细胞贴壁生长至70%~80%时进行细胞传代。选择生长状态良好的U87细胞,按照Lipofectamine 3000试剂(美国Invitrogen公司)说明书进行转染,在培养24~48 h后进行下一步实验。
1.2.2 实时荧光定量PCR实验
按照PCR试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)说明书进行实时荧光定量PCR实验,得到各组循环阈值(CT值),以GAPDH作为内参基因,计算2-ΔΔCt值。
1.2.3 CCK-8实验
按照每孔2000个细胞种植在96孔板中,按照CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书,分别在0、24、48、72、96 h时,在对应孔中加入CCK-8试剂,并在酶标仪上设定CCK-8检测参数(450 nm波长处的吸光度)后,重复测量3次吸光度,绘制生长曲线,并进行统计分析。
1.2.4 细胞周期实验
取细胞状态良好,并且处于对数生长期的细胞消化,按照细胞周期试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司)说明书,加入完全培养基终止消化;离心,加入完全培养基轻轻吹打重悬,用移液枪将重悬液吸入六孔板中,48 h后收集细胞。吸取PBS洗涤2遍,消化细胞,1500 r·min-1离心5 min,弃上清。用PBS洗2遍,1500 r·min-1离心5 min,弃上清,用残余的液体重悬细胞。用-20 ℃预冷的75%乙醇重悬细胞,封口膜封闭流式管管口,-20 ℃保存过夜。1 mL PBS洗1遍,1500 r·min-1离心5 min,弃上清。加入200 μL的DNA staining solution,震荡10 s,室温避光孵育30 min。流式细胞仪上机检测,对实验数据进行统计分析。
采用SPSS20.0统计软件进行数据分析,数据为至少3个独立实验的均值。组间比较采用t检验或单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
实时荧光定量PCR实验显示:miR-586在胶质母细胞瘤组织中的表达显著高于非肿瘤脑组织中的表达(P<0.001,图1A);胶质瘤细胞系中miR-586的表达水平也高于正常人星形胶质细胞中的表达,其中U87细胞中miR-586的表达水平显著高于人正常星形胶质细胞(P<0.05,图1B)。
CCK-8实验显示:使用miR-586 inhibitor转染U87细胞抑制miR-586表达后,U87细胞的增殖能力明显下降(P<0.01,图2)。
细胞周期实验显示:使用miR-586 inhibitor转染U87细胞抑制miR-586表达后,U87细胞周期处于G0/G1期细胞数量明显增加,处于S期减少(P<0.01,图3)。
胶质瘤起源于前体细胞和神经胶质细胞,由于广泛的颅内侵袭性,患者2年生存率较低[5-6]。随着分子生物学的发展,在分子层面探究更多的肿瘤治疗靶点十分必要。有研究[7-8]表明,miRNA在疾病进展(包括肿瘤发生和肿瘤进展等)中,是涉及这些生物过程的关键调节因子。并且miRNA可以在多个方面影响生物学过程,包括细胞增殖、分化和凋亡[9]。
本研究聚焦于miR-586对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响。实验结果表明抑制miR-586能够导致U87细胞增殖能力明显下降。YANG等[10]发现抑制miR-586的表达能够诱导骨肉瘤细胞阻滞在G0/G1期,过表达miR-586则得出了相反的结论。本研究也得出了同样的结论,通过构建miR-586 inhibitor质粒降低miR-586的表达,发现抑制miR-586能将U87细胞周期阻滞在G0/G1期(图3)。这也再次表明抑制miR-586能够影响肿瘤细胞周期阶段。有研究[11]报道,miR-181a和miR-181b在人胶质瘤细胞中作为肿瘤抑制因子发挥作用。相反,在胶质瘤细胞瘤患者中发现miR-1238高表达与替莫唑胺耐药显著相关[12]。因此,miRNA的失调被认为是胶质瘤治疗的一个方向。
综上所述,本研究对miR-586在人胶质瘤中表达和对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响进行探索,发现miR-586在胶质瘤组织和细胞中表达上调,抑制miR-586的表达可以抑制胶质瘤细胞增殖并诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,为胶质瘤分子治疗提供了新的方向。明确miR-586影响胶质瘤的机制还需要更进一步的探索研究。