转录因子Sp7/Osterix的研究进展

李紫玲(综述)，李经堂(审校)

(1.南昌大学医学院临床医疗系2016级；2.江西省人民医院骨科，南昌 330006)

基因工程技术修复骨缺损是骨组织工程学发展方向，通过基因技术将编码与骨组织再生相关的生长因子基因片段转移至种子细胞中，使种子细胞持续高效表达促骨生长因子，从而促进骨形成，这在骨组织工程技术中有重要研究意义[1]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)是经典的骨生长因子[2]，在 BMP2促进成骨信号通路中，Sp7/Osterix(Osx)是一特异性的成骨细胞转录因子。Osterix于2002年由NAKASHIMA等[3]在BMP2诱导的成肌细胞C2C12中首次发现，它位于BMP2下游，通过Wnt/β-Catenin通路、NO66等多种反馈调控机制调控成骨细胞分化，参与骨形成[4]，对骨骼形成至关重要。

1 Osterix蛋白结构与Sp7基因定位

Osterix是一种由428个氨基酸组成的具有典型转录因子结构特征的多肽，其分子质量为46 kDa。因Osterix与Sp(special protein)家族中的Sp1，Sp3和Sp4具有高度同源性，故将其归于SP/XKLF家族，人类Osterix的同源物又称Sp7。

Osterix碳末端存在3个C2H2型锌指基序结构，为其DNA结合域，能与富含GC的真核细胞启动子牢固结合，调控基因转录[5]。锌指结构域的上游存在一串与早期生长反应因子1(early growth response protein 1，EGR-1)区域氨基酸相似的碱性氨基酸，对核定位起重要作用。Osterix亦包含了一个由27～192位氨基酸残基构成的转录激活区域，该区富含脯氨酸和丝氨酸。Osterix氮末端存在富含脯氨酸的区域(proline-rich region，PRR)，可介导蛋白质相互作用，并通过抑制Wnt信号通路负向调控成骨细胞增殖[6]。

Osterix的亚细胞定位局限于细胞核内，小鼠的Osterix基因位于15号染色体上Wnt10b和Itga5之间[3]。应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术进一步定位人类的Sp7基因，确定其位于人类染色体12q13.13处[7]。

2 Osterix在组织中的表达与功能

2.1 Osterix与骨形成

NAKASHIMA等[3]通过研究小鼠胚胎的发育过程，最早在13.5 d的胚胎中分化的软骨细胞和外周软骨膜中检测到了Osterix的表达，并且15.5 d及以后的胚胎中所有骨小梁相关细胞和骨领形成相关细胞中均有高表达的Osterix。出生13 d后的小鼠骨小梁和次级骨化中心都存在Osterix的高表达，同一时期的骨基质、骨内膜和骨外膜也有Osterix表达。敲除Osterix基因的小鼠表现出颅盖骨骨化延迟和颅面畸形[8]。Osterix还被证实可以限制颅骨的起始发生位置，并参与颅缝的形成[9]。这些实验结果表明Osterix对促进成骨细胞的分化和骨形成至关重要。

runt相关基因2(runt-related transcription factor 2，Runx2)为具有异聚体的转录因子多瘤病毒增强结合因子2/核结合因子的α亚单位(Runx2/Cbfα1)，是另一个调控成骨细胞分化的重要特异性转录因子。在Osx(-/-)小鼠中Runx2的表达水平是正常的，说明Osterix对于Runx2的表达并不是必需的，而在Runx2剔除小鼠中则未见Osterix表达，提示Osterix作为Runx2的下游基因发挥成骨作用[3]。有研究[10]证实Runx2/Osterix 可以和锌(Zn2+)协同作用调节成骨分化。Osterix还被证明可以上调成熟成骨细胞下游标志物的表达，包括半胱氨酸分泌蛋白(secreted protein acidic cysteine-rich，SPARC)，骨桥蛋白(osteopontin)，骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)，骨钙蛋白(osteocalcin)和碱性磷酸盐(alkaline phosphatase，ALP)。此外，Osterix也影响了成骨细胞的迁移、凋亡和死亡[11]，且能抑制成骨细胞的增殖[6]。MOON等[12]还发现成骨细胞中Osterix的破坏会导致皮质化过程延迟、成骨细胞分布异常以及肢体长度减短。

最近有研究应用转基因技术，在小鼠次级骨化中心发生之前条件性地破坏骨骺软骨细胞中Osterix的表达，发现小鼠胫骨骨骺的继发骨化受损，说明Osterix在软骨细胞肥大、分化为成骨细胞和次级骨化时软骨向骨转变过程中均起关键作用，研究还发现Osterix可上调软骨细胞肥大标志物表达，包括X型胶原蛋白(collagen type X，Col10)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP13)[13]。Osterix被募集到-30 kb、-20 kb和启动子近端区域以激活MMP13表达[14]。软骨基质相关蛋白(cartilage matrix-associated protein，Ucma)是由LEE等[15]发现的Osterix下游基因，可促进成骨细胞分化和结节形成。NIU等[16]利用Osterix突变体斑马鱼模型，发现Col10ɑ1a作为成骨细胞标志物之一而位于Osterix下游。

2.2 Osterix与牙发育

有研究[17]表明Osterix能以特定位点的方式调节成牙本质细胞的分化、成熟和根伸长，是牙根形成中必不可少的因子。Osterix基因在斑马鱼牙冠部牙基质发育矿化中发挥了一定作用[18]，此外有研究发现Osterix在成牙本质细胞内的表达存在时间特异性，在分泌牙本质基质的阶段表达强烈[19]。CHOI等[20]继续发现在牙骨质形成过程中，Wnt/β-连环素(β-Catenin)通路的T细胞因子/淋巴增强因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，Tcf/Lef)的结合活性依赖于Osterix的表达。在上颌骨成骨过程中，Osterix存在于Meckel软骨附近未分化的外基质细胞和腭突的骨化中心[21]。

2.3 Osterix与脂肪形成

Osterix可直接与各种蛋白质相互作用调节它们的功能活性。有研究发现Osterix能与脂肪形成标志物之一过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPAR-γ)的配体结合域(ligand-binding domain，LBD)结合，负向调节其转录活性，抑制了罗格列酮诱导的脂肪生成[22]。

2.4 Osterix与肿瘤

此外，早已发现在一些与骨相关的肿瘤细胞如骨肉瘤细胞、骨巨细胞瘤间质细胞中存在Osterix。LIU等[23]发现骨髓瘤细胞中高表达的胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)能降低成骨细胞中Osterix表达水平，从而抑制了成骨细胞分化，增强了破骨细胞活性，使骨骼重塑的平衡转变为骨组织的净损失。YAO等[24]发现Osterix在乳腺癌细胞中高表达，与侵袭相关的分子MMP9是Osterix新的下游靶点。Osterix可通过上调赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)的表达而促进乳腺癌侵袭和骨转移，提示预后不良[25]。

PARK 等[26-27]还发现发育的小鼠胚胎中嗅球存在Osterix表达，小脑和大脑皮层则有低水平表达的Osterix。WU等[28]则发现Osterix谱系细胞可能促进了结节性硬化症(tuberous sclerosis complex，TSC)患者肾囊肿的发生。

相信在未来的研究中会揭示Osterix在更多生命过程中的联系与机制。

3 Osterix表达的调控

目前已证实多条调控Osterix的细胞信号转导通路(图1)[29-43]，包括经典的丝裂原活化蛋白激酶信号系统(mitogen activated protein kinase cascsde，MAPK)途径、转化生长因子β/骨形态发生蛋白信号转导蛋白(TGFβ/Smad)信号通路和Wnt/β-Catenin通路，其中MAPK通路主要有4条，即细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)1/2通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、p38 MAPK通路及ERK5通路。值得指出的是，上述信号通路并非独立作用，而是相互联系，共同调控着Osterix表达，组成了错综复杂的信号调节网络。SAKISAKA等[29]发现Wnt3a是通过活化p38 MAKP从而上调牙囊细胞中Osterix表达，此过程并不受Wnt-受体相关蛋白(receptor-related protein，LRP)5/6-糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)轴调节。

SUBRAMANIAM等[30]证实TGFβ诱导早期基因-1(TGFβ inducible early gene-1，TIEG-1)直接与Osterix启动子结合，在Osterix上游发挥作用，是BMP2和TGFβ介导的诱导Osterix表达过程中所必需的。在Osterix翻译水平上，目前发现的一些调节点主要在起始阶段。近年来有研究通过间歇流体剪应力(intermittent fluid shear stress，IFSS)证实机械敏感性瞬间受体电位离子通道蛋白7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)通过激酶磷酸化、胞内钙沉积和成骨标志基因表达上调激活Osterix通路[31]。

Osterix蛋白的功能活性可被各种转录后修饰调控，包括磷酸化、酰基化、泛素化和甲基化。CHOI等[32]最新发现，非受体型酪氨酸激酶之一c-Src蛋白通过Osterix的磷酸化提高其蛋白稳定性、成骨活性和转录活性。XU等[33]发现Ser422是Osterix一个磷酸化新位点，GSK3β正是在此位点与Osterix相互作用。而Osterix中Ser76和Ser80残基的磷酸化对增强连接蛋白43(connexin 43，Cx 43)启动子活性具有至关重要的作用[44]。SIRT7，一种高度特异性的H3K18Ac(组蛋白H3的乙酰化18位赖氨酸残基)去乙酰化酶，最近被证实可使Osterix碳末端第368位赖氨酸(K)去乙酰化，从而促进其氮末端的转录活性，另外这种去乙酰化还促进了SIRT1的Osterix去丙酰化作用，从而增强Osterix的转录活性[34]。

值得注意的是，Osterix是一个不稳定蛋白，其稳定性受泛素-蛋白酶体系统调节[45]。近年来，除了发现高度保守和特异的多肽脯氨酰基顺反异构酶Pin1可抑制多泛素介导的Osterix蛋白酶体降解[35]，还发现褪黑素也通过抑制泛素-蛋白酶体介导的Osterix降解以稳定其表达[36]。与此作用效应相反，RING指型E3泛素连接酶Cbl-b和c-Cbl可增强泛素化，诱导Osterix降解，达到抑制Osterix功能的目的[37]，Hsp70相互作用蛋白(CHIP或STUB1)羧基末端的E3连接酶亦可调节Osterix表达，削弱成骨细胞分化[38]。

除此之外，小分子RNA如miR-302b也参与了Osterix的表达调控[39]。我国学者SUN等[40]研究发现一个在人和小鼠成骨细胞中都特异性上调的长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)分子，命名为lnc-Ob1。他们进一步研究发现lnc-Ob1通过抑制Osterix启动子的组蛋白H3的第27号位氨基酸(H3K27me)上三甲基化，显著上调Osterix表达。在成骨细胞的细胞核内，lnc-Ob1能够与多梳蛋白Suz12结合，削弱了H3K27甲基化酶复合体在Osterix启动子上的募集程度，从而增强Osterix表达。

Osterix在含Dlx的调控复合物中充当转录共激活因子[46]。肿瘤抑制因子p53抑制Osterix与其成骨靶基因启动子的Sp1/GC富含位点结合，且这种相互作用使Osterix与远端缺失基因5(distal less like gene 5，Dlx5)分离，此竞争阻碍了Osterix充当Dlx5辅助因子激活含同源域启动子的能力[41]。其他陆续发现的影响Osterix表达的因素还有胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)[47]和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)[48]。XING等[49]通过实时PCR发现，当正常小鼠血清中甲状腺激素水平达到峰值时，甲状腺激素缺乏鼠骨骺中Osterix表达严重受损。进一步发现甲状腺激素对Osterix表达的调控是通过激活甲状腺激素受体β1信号转导而实现的[42-43]。

4 与Osterix相关的临床疾病

骨质疏松症是由骨吸收增加和骨形成减少引起的骨疾病，其临床治疗包括使用双磷酸盐(如阿仑磷酸盐、利塞磷酸盐或唑磷酸盐)或RNA配体(RANKL)抑制剂减少骨吸收。另一种方法是增加骨形成，目前临床应用的唯一高效促进骨形成药物甲状旁腺激素PTH[50]，存在使用年限短、治疗骨折不敏感、潜在骨肉瘤风险等弊端，新的骨形成药物亟待研发。王晓刚团队利用前期构建的成骨细胞靶向递送系统[51]，实现了卵巢切除所致骨质疏松小鼠的lnc-Ob1靶向基因治疗，结果发现治疗后的小鼠骨形成能力显著增强，骨量显著增加，提示骨组织特异性lncRNA可能是一个骨质疏松精准治疗的潜在靶点[42]。其他近年来新发现的各种调节Osterix表达的因子，提示了治疗骨质疏松的其他可能靶点，为骨形成药物的开发提供了新的策略。HAN等[36]发现，褪黑素可提高Osterix蛋白稳定性，并通过PKA和PKC信号通路调节其表达，这为褪黑素作为有效治疗骨质疏松症的药物提供了进一步的证据。

鉴于Osterix在骨皮质形成过程中的重要作用，临床上对身材矮小的治疗也许可以通过上调Osterix表达而实现[12]。在多发性骨髓瘤患者骨损伤的预防和治疗中，抑制TP活性从而增加Osterix表达具有重要临床意义[23]。SHI等[52]发现颈椎后纵韧带骨化症(ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL)由Osterix通过Wnt/β-Catenin信号转导途径介导发生。还有研究发现miR-302/367家族成员miR-302b可通过调控BMP2/Runx2/Osterix信号通路，提高钙磷代谢，抑制血管钙化，缓解大鼠慢性肾衰的状况，这为慢性肾衰的治疗开辟了新思路[39]。在2型糖尿病肾病大鼠模型的肾动脉组织中，Osterix表达随病程进展而增加，阻断Osterix相关信号通路有望成为防治糖尿病血管钙化的治疗靶点[53]。

由于Osterix在骨组织细胞外没有任何可测量的范围，因此它不仅可作为用来确定骨组织工程构建体再生潜力的关键标志物，而且可确定成骨特异性细胞的定位和迁移。有实验从人体天然骨中取出人供骨膜组织，将其包裹在合成聚合物支架上，植入裸鼠体内10周后，用免疫组化方法鉴定骨膜细胞中Osterix的存在和定位，以确定人供骨膜是否保持生物活性和成骨潜能[54]。这一作用促进了临床应用骨组织工程技术治疗各种原因导致的骨缺失疾病。

5 结语

随着对Osterix各方面的深入研究，人们对其在各种生命过程中的作用有了越来越清晰的认识。Osterix作为成骨细胞特异转录因子被发现，其对骨形成的重要性不容小觑。通过细致深入研究影响Osterix表达的细胞信号通路和陆续发现各种新的上下游因子，可以极大地推动靶向特定通路或位点的促进骨形成药物的开发进程，同时促进骨组织工程的发展，为临床上精准治疗各种骨相关疾病提供新思路和策略。