槲皮苷对噪声诱导神经性耳聋小鼠的保护作用

王立娟，齐 亮，叶 琳，王彦珍，罗安平

(保定市第二医院耳鼻喉科，河北 保定 071000)

急性听力损失(hearing loss，HL)是工业国家常见的感觉障碍疾病之一，目前已影响到全球约6.8%的人口。HL在2013年和2015年被列为“残疾”的第四大原因，仅次于腰背和颈部疼痛、抑郁障碍和铁缺乏症[1-2]。噪声诱导的神经性耳聋(noise-induced hearing loss，NIHL)是感音神经性耳聋(sensorineural hearing loss，SNHL)的一种，是由于螺旋器毛细胞、听神经、听觉传导经路或各级神经元受损害所导致的声音感受与神经冲动传递障碍造成的听力减退[3]。尽管近年来有许多与其相关的药物研发，但至今还没有明确的治疗神经性耳聋的方法[4]。NIHL的机制包括直接机械损伤和代谢损伤。过度的噪音会对中耳结构、圆形和椭圆形的窗膜以及皮质器官造成损害。耳蜗的外毛细胞(outer hair cells，OHC)极易受到噪声的影响。噪声会扭曲毛细胞的纤毛，导致机械传导的缺陷[5-6]。现有的证据[7]表明，氧化自由基的形成是SNHL的关键途径，自由基可通过邻近细胞的坏死或凋亡破坏细胞膜。以往研究[8]显示，将C57BL/6J小鼠暴露在110 dB 声压级(sound pressure level，SPL)噪声下1 h，可导致周围淋巴中的羟基自由基增加4倍，同时导致OHC损伤。同时，有研究[9]认为HL发生与活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成所造成的炎症级联反应有关，这一反应可增加细胞的自噬反应从而诱导毛细胞的死亡。

槲皮苷(Quercetin，Que)是一种广泛存在于植物中的黄酮类单体化合物。据报道[10]，Que具有有效清除羟自由基、超氧阴离子自由基以及二苯代苦味肼基等活性氧自由基的能力，并具有一定的抗炎活性。据此，笔者推测，Que可能对神经性耳聋具有潜在的保护作用。基于此，本研究将观察Que对NIHL小鼠的作用，并基于氧化应激及自噬探讨其作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：40只1.5～2.0个月龄的成年雄性C57BL/6小鼠由河北医科大学实验动物中心提供，并置于无特定病原体级环境饲养，所有小鼠自由获得食物和水，均接受外耳、中耳及内耳的检查以排除实验前内耳听力功能对实验的影响。本研究已取得保定市第二医院伦理委员会同意。

实验仪器：2446J动态扬声器(美国JBL)，REVOL听觉脑干电位仪(丹麦Dantec)，SZ51解剖显微镜(日本Olympus)，LSM 780激光共聚焦显微镜(德国Zeiss)。

实验试剂：Que(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；曲拉通X-100(Triton X-100)和3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)抗体(美国Sigma-Aldrich)；C端结合蛋白2(C-terminal binding protein 2，CtBP2)抗体(美国BD Biosciences)；Ⅶ型肌球蛋白(myosin Ⅶ)抗体(美国Proteus Biosciences)；鬼笔环肽(Phalloidin)、Alexa Fluor 568和647荧光标记二抗、4-羟基壬醛(4-hydroxynonaldehyde，4-HNE)抗体(美国Invitrogen)；微管相关蛋白轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B)抗体(英国Abcam)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

小鼠按照随机对照表法随机分成4组：对照组(Con组)、噪声暴露组(Noise组)、低剂量Que治疗组(L-Que组)、高剂量Que治疗组(H-Que组)，每组10只。除Con组外，其余3组小鼠置于悬挂有动态扬声器的笼子内，并暴露于105 dB SPL的8 kHz纯音噪声中，每天持续6 h，连续7 d；其中L-Que组和H-Que组小鼠在每天噪声暴露前30 min分别给予腹腔注射50 mg·kg-1·d-1和100 mg·kg-1·d-1的Que生理盐水溶液，持续7 d；Noise组小鼠在同时间段给予腹腔注射等体积生理盐水。Con组小鼠除不进行噪声刺激外，其他步骤同Noise组。从首次给予噪声后第7 d，将长度为1.5 mm的针形电极插入小鼠头皮两侧耳廓后面的眼间背中线(无倒置)，并使用点击音和全频程刺激，分别在8、16、24和32 kHz频率记录小鼠听觉脑干反应(auditory brainstem response，ABR)阈值[11]。根据何景春等[12]的研究，当Noise组小鼠的ABR测试观察到小鼠听觉反应阈上升≥10 dB时，即表明神经性耳聋模型造模成功。

1.2.2 耳蜗组织的收集

各组小鼠完成听力测试后，用5%水合氯醛完全麻醉，断头并取下颞骨放入0.1 M的PBS溶液中，解剖显微镜下打开听泡，去除镫骨，挑破圆窗膜及卵圆窗膜，蜗尖打孔，并从蜗尖灌注4%多聚甲醛。取出耳蜗并放入4%多聚甲醛液内4℃过夜。将收集的耳蜗用0.1 M的PBS冲洗，再用1M的稀盐酸脱钙5 h，然后用0.1 M的PBS再次冲洗后，在解剖显微镜依次从蜗尖至蜗底分离出全耳蜗基底膜。

1.2.3 免疫荧光染色及激光共聚焦观察耳蜗组织

耳蜗基底膜切成5个片段，用含Triton X-100的封闭溶液室温悬浮1 h后，耳蜗各片段分别用myosin Ⅶ、CtBP2、Phalloidin、3-NT、4-HNE和LC3B抗体(均1:200)室温孵育2 h，0.1 M的PBS冲洗3次，然后室温孵育Alexa Fluor 568、647荧光标记的二抗(1:200)1 h，0.1 M的PBS再次冲洗3次后，用激光共聚焦显微镜在与ABR测试频率相对应的位置对免疫荧光染色的耳蜗进行成像，每组任取5张随机图像，并利用Image J统计3-NT、4-HNE和LC3B的相对表达量。利用Image J软件对myosin Ⅶ染色显示耳蜗结构进行频率定位，生成了耳蜗位置-频率图。用高分辨率油成像物镜在1024×1024光栅(135 μm2)中收集Z型叠层，用Zen Blue软件根据每个频率沿75 μm的长度耳蜗的CtBP2染色细胞核数对内毛细胞(inner outer hair cells，IHC)和OHC进行计数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠ABR阈值的比较

在点击音刺激下的ABR检测结果显示，Con组、Noise组、L-Que组和H-Que组的ABR阈值分别为(20.12±2.03)、(69.31±4.32)、(48.34±7.32)和(37.61±5.42)dB SPL，Noise组较Con组的ABR阈值显著升高(P<0.001)，L-Que组和H-Que组较Noise组的ABR阈值显著降低(均P<0.01)。见图1A。全频程ABR检测结果显示，Noise组在8、16、24和32 kHz频率均较Con组的ABR阈值显著升高(均P<0.001)，L-Que组和H-Que组在8、16、24和32 kHz频率均较Noise组的ABR阈值显著降低(均P<0.05)。见图1B。

2.2 各组小鼠耳蜗毛细胞损伤的比较

如图2A显示，Con组耳蜗的顶回(8 kHz)、中回(22.4 kHz)和底回(45 kHz)片段的OHC和IHC结构完整且排列整齐；Noise组顶回和中回片段的IHC结构完整且排列整齐，底回片段的IHC有所缩短，顶回片段的OHC排列疏松，中回和底回片段的OHC明显减少甚至底回片段的OHC丧失；L-Que组和H-Que组顶回、中回片段的IHC结构完整且排列整齐和底回片段的IHC结构有所改善，顶回片段的OHC排列趋向整齐，中回和底回片段的OHC数量的减少的程度较轻，且H-Que组减少幅度更小。计数结果显示，Con组、Noise组、L-Que组和H-Que组IHC数量无明显变化(图2B)；与Con组比较，Noise组在对应于频率>22.4 kHz的耳蜗的位置处的OHC密度显著降低(P<0.001)；与Noise组比较，L-Que组和H-Que组对应于频率>22.4 kHz的耳蜗的位置处的OHC密度显著增加(均P<0.05)(图2C)。

2.3 各组外毛细胞3-NT和4-HNE表达水平的比较

免疫荧光结果显示，与Con组比较，Noise组OHC中3-NT和4-HNE的表达水平均显著增加(P<0.001)；与Noise组比较，L-Que组和H-Que组OHC中3-NT和4-HNE的表达水平均显著降低(均P<0.01)，且H-Que组更低(P<0.001)。见图3。

2.4 各组耳蜗外毛细胞LC3B表达水平的比较

免疫荧光结果显示，与Con组比较，Noise组OHC中LC3B的表达水平显著增加(P<0.001)；与Noise组比较，L-Que组和H-Que组OHC中LC3B的表达水平显著降低(均P<0.01)，且H-Que组更低(P<0.001)。见图4。

3 讨论

近年来，由于NIHL发病率的增高却缺乏行之有效的治疗方法，使其成为广受关注的公共卫生难题。因此，积极寻找潜在的抗NIHL的药物具有重大的意义。

NIHL的主要病变部位在耳蜗毛细胞。正常情况下根据声音刺激放大基底膜的运动，OHC比IHC更容易受到噪声伤害，故OHC死亡是该疾病的基础病理学改变[13]。本研究发现，在NIHL小鼠中，耳蜗OHC呈现数量的减少，IHC改变不明显，表明噪声可诱导OHC的死亡；而Que可改善噪声引起的OHC丢失，提示Que可能对NIHL小鼠具有保护作用。以往的研究证据[14-15]表明，NIHL的早期损伤为患者耳蜗机械损伤引发其局部组织发生代谢异常所致，且氧化应激、自噬反映是其发生的重要环节。噪声暴露后耳蜗组织会产生过多的活性氧自由基，升高过氧化物的含量，造成不良的氧化应激反应[16-17]。若生成的过氧化物不能及时清除，则会损伤耳蜗组织，造成听觉的损害。过氧化物3-NT和脂质过氧化物4-HNE的含量常用来衡量机体氧化应激水平[18]。本研究结果显示，Que可降低噪声暴露导致的3-NT和4-HNE，提示Que可能通过减轻氧化应激水平来改善噪声诱导的耳蜗损伤。自噬是通过形成自噬体，包裹胞浆中受损的蛋白质及亚细胞器成分，并与溶酶体融合形成自噬体，进而降解的代谢过程[19]。LC3B是细胞自噬活化过程中的关键分子，可有效反映细胞的自噬情况[20]。本研究发现，Que可降低噪声暴露导致的自噬标志物LC3B表达，提示Que可减轻由噪声诱导的小鼠耳蜗OHC的细胞自噬。已有的研究证据[21-22]表明，氧化应激可诱导自噬性死亡的产生，而在本研究观察到Que可同时改善NIHL模型小鼠的氧化应激水平和自噬水平，且经Que处理后OHC细胞死亡数量更少，由此提示Que可能通过减轻耳蜗OHC的氧化应激和自噬作用来发挥抗NIHL的作用。

综上，本研究显示，Que对NIHL小鼠具有保护作用，其保护作用可能是通过减轻耳蜗OHC的氧化应激和自噬作用来实现的，提示Que可能是潜在的抗NIHL药物。