2017——2019年广西猪重要病毒性腹泻病原流行病学调查

严瑾 施开创 刘宏梅 谢守玉 覃勇 黎宗强 尹彦文

（1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁530005；2.广西动物疫病预防控制中心，广西 南宁530001；3.百色市动物疫病预防控制中心，广西 百色市533000）

病毒性腹泻是严重危害养猪业的一类重要疫病，猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRoV）是其中4种主要病原。PEDV可以感染各个年龄段猪群，发病猪以厌食、水样腹泻、呕吐以及脱水为主要症状。该病毒在1971年首次被英国学者报道，中国1980年首次报道该病，目前世界上主要养猪国家均有该病流行［1］。PDCoV是2014年新发现的一种猪肠道致病性冠状病毒，可致各个年龄猪尤其是仔猪的呕吐、腹泻、脱水甚至死亡，临床症状与PED相似［2］。TGEV于1946年美国首次分离得到，可以导致各种年龄猪的急性胃肠道传染病，临床症状与PDCoV极其相似，仔猪死亡率可达100%，成年猪极少死亡［3］。PRoV在1968年首次分离得到，临床症状与PEDV相似，各种年龄猪均易感，成年猪多呈隐性感染，仔猪发病率和死亡率较高［4］。PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV所致疫病不仅临床症状相似，还经常存在混合感染、继发感染，增加猪群的发病率和死亡率，是目前危害养猪业的重要病原。加强上述四种病原的流行病学调查，是做好病毒性腹泻防控的重要基础。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2017-2019年来自广西各地规模化猪场送检的因腹泻死亡猪的肠道及其内容物、病猪的肛门拭子等腹泻样品，共1463份，置于-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0核酸抽提试剂盒、PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、2×Taq PCR Master Mix试剂盒、DL2000 DNA Marker等均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 病料处理

肛门拭子的处理：将肛门棉拭子置于1.5 mL离心管中，按1∶3（W/V）加入灭菌生理盐水，震荡后离心，取200µL上清液，进行RNA抽提。

粪便的处理：将粪便加入1.5 mL离心管中，按1∶3（W/V）加入灭菌生理盐水，震荡离心，取200µL上清液，进行RNA抽提。

肠组织及内容物的处理：选取肠组织及内容物，剪碎，置于灭菌1.5 mL离心管中，按1∶3（W/V）加入灭菌生理盐水，再加入两颗研磨钢珠，经组织捣碎机捣碎，反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min，取200µL上清液，进行RNA抽提。

按照核酸抽提试剂盒说明书，提取样品RNA后，按照反转录试剂盒反转录成cDNA，将其置于-80℃保存备用。

1.4 PDCoV、PEDV、TGEV及PRoV的检测

参照本实验室建立的PDCoV、PEDV、TGEV及PRoV多重RT-PCR检测方法［5］，以cDNA为模板，进行PCR扩增。PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV扩增片段大小分别为183 bp、750 bp、544 bp、329 bp。在阴、阳性对照成立前提下，当出现扩增的目的条带时，判定为阳性；否则为阴性。

1.5 数据统计与分析

对不同年度、季节、地区和病种的检测结果进行分析，利用卡方检验计算器V1.70发生数格式、确切概率计算卡方进行差异性分析，当P≤0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 病原检测结果

2017-2019年从广西各地养猪场采集的1463份腹泻病料进行多重RT-PCR，检测PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV如表1所示。由表1可见，PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV的检出阳性率分别为5.67%、10.12%、1.30%和5.95%。2017-2019年，广西部分地区PDCoV阳性率分别为8.33%、5.81%和3.82%，阳性率呈逐年下降，2019年同比2017年下降差异显著（P≤0.05）；PEDV阳 性 率 分别为12.70%、9.72%和9.31%，各年差异不显著（P＞0.05）；TGEV阳性率分别为0%、1.77%和1.19%，2018年和2019年差异不显著（P＞0.05）；PRoV阳性率分别为0.40%、6.31%和8.59%，2019年同比2017年显著上升（P≤0.05）。结果表明，2017-2019年间广西部分地区PDCoV、PEDV阳性率不断下降，而PRoV阳性率则在逐年上升。

表1 2017-2019广西各地临床腹泻样品检测结果

2.2 病原时间分布

对1463份病料的检测结果按季节进行统计分析（见表2），2017-2019年四个季度中，PDCoV阳性率最高为第二季度，达10.14%，与第一、四季度差异显著（P≤0.05），与第三季度差异不显著（P＞0.05）；PEDV阳性率最低为第二季度4.06%，并与其他季度差异显著（P≤0.05），第一、三、四季度间差异不显著（P＞0.05）；TGEV阳性率最高为第三季度5.50%，并与其它季度差异显著（P≤0.05），第一、三、四季度间差异不显著（P＞0.05）；PRoV阳性率最低为第二季度1.45%，并与其他季度差异显著（P≤0.05），第一、三、四季度间差异不显著（P＞0.05）。结果表明，PEDV全年均可发病，高峰期在第二、三季度，第一、四季度发病率相对较低；PDCoV主要在冬春季节发生，但感染猪场全年都可发病；TGEV主要集中在第三季发生，第二季度未检测出阳性；PRoV一年四季均可检测出阳性，第二季度阳性率相对比较低。

表2 2017-2019广西各地腹泻样品检测结果季度统计表

2.3 病原地区分布

2017-2019年从广西9个地级市采集的1463份腹泻病料PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV检测结果如表3所示。由表3可知，根据相同病原在不同地区的平均阳性率统计显示，PDCoV阳性率在百色市最高，为9.25%，与其他地区差异显著（P≤0.05）；PEDV阳性率在玉林市最高，阳性率为50.00%，但由于样本数比较少，与多数地区差异不显著（P＞0.05）；TGEV阳性率在桂林市最高，为33.32%，除与南宁市差异不显著外，与其他地区差异显著（P≤0.05）；PRoV阳性率在贺州市最高，为50.00%，与其他地区差异显著（P≤0.05）。结果表明，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的发生具有地域差异性。

表3 2017-2019广西各地腹泻样品检测结果地区分布统计表

2.4 PDCoV与PEDV、TGEV、PRoV混合感染情况

PDCoV与PEDV、TGEV、PRoV混合感染情况如表4所示。由表4可知，在所检测的1463份病料中，2种病原混合感染的阳性率为5.26%，3种病原混合感染的阳性率为1.64%。PEDV+PDCoV、PEDV+TGEV、PEDV+PRoV阳性率分别为2.32%、0.21%、2.19%；PDCoV+TGEV、PDCoV+PRoV阳 性 率 为0.27%、0.27%；TGEV+PRoV阳性率为0.14%；PDCoV+PEDV+PRoV三重感染阳性率为1.64%。

表4 2017-2019广西各地临床腹泻样品混合感染情况

3 小结与讨论

近年来，由各种猪腹泻病毒感染所造成的猪群发病率和死亡率不断升高，给养猪业造成了严重损失。徐丽华等［6］调查2011-2017年浙江省部分猪群，发现PEDV、PDCoV、TGEV和PRoV阳性率分别为71.25%、8.75%、3.05%和17.67%；混合感染中，PEDV+PDCoV、PEDV+TGEV、PEDV+PRoV、PDCoV+PRoV阳性率分别为2.80%、2.40%、15.10%、0.50%。王颢然等［7］对2008-2018年我国PEDV混合感染病例进行统计，发现全国18个省市6951份样本中，PEDV阳性3345份，阳性率为48.12%、混合感染1325份，阳性率为19.06%，混合感染主要以二重为主阳性率为15.41%，三重、四重混合感染分别为3.25%和0.40%。田云等［8］对广东省19个地市236份腹泻样品进行检测，PEDV阳性率为33.05%，PRoV阳性率为17.8%，未检出TGEV。李炳晓等［9］对2017-2018年河南省部分地区仔猪腹泻病料进行检测，结果表明，PEDV、PDCoV阳性率分别为35.06%、51.92%，二者混合感染阳性率为24.03%。何颖等［10］对2013-2018年广西各地1574份腹泻样品进行检测，结果表明，PEDV、PDCoV、TGEV和PRoV阳性率分别为54.94%、4.52%、4.40%和0%，混合感染中以PEDV+PDCoV和PEDV+PRoV混合感染较多，三重感染情况较少；PEDV四季的感染率分别为50.43%、45.19%、60.49%和63.19%，PDCoV四季的感染率分别为8.12%、1.56%、0.49%和5.11%，PRoV四季的感染率分别为5.34%、8.05%、3.41%和1.02%。段群棚等［11］对广西2016-2019年914份病料进行监测，发现PEDV无明显的发病季节，夏季猪群也会持续感染，这与本实验的结果一致。以上结果表明，PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV等是引起仔猪腹泻的重要病原，而且存在混合感染、继发感染情况。

本研究对2017-2019年广西各地的腹泻病料进行检测发现，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的阳性率分别为5.67%、10.12%、1.30%和5.95%；2种病原混合感染的阳性率达到5.26%，三种病原混合感染的阳性率达到1.64%。结果表明，PEDV是导致猪腹泻的主要病原，PDCoV、TGEV和PRoV也有感染，而且混合感染较为严重。在不同地区、不同季度可能会感染不同的病原，病原之间可能存在相互作用，导致不同的发病率和死亡率［12］。与其他省份相比，广西猪群TGEV、PEDV以及PRoV的阳性率普遍低于其他省份，这可能与广西部分猪群接种PEDV-TGEVPRoV三联弱毒苗有关，疫苗的接种能够有效的预防腹泻的发生，降低发病率和死亡率。但目前尚未有PDCoV商品化疫苗，对该病的防控，可以通过对环境的控制来降低猪群的感染率和发病率［13］。广西猪群的腹泻主要发生在冬春季节，可能是由于广西属于亚热带地区，每年冬春季节，广西地区阴雨连绵，气候潮湿阴冷，昼夜温差大，容易引起猪群的应激反应，导致猪群的免疫力下降，诱发腹泻。因此，要在冬春季节，在免疫相应疫苗的基础上，应注意猪群的防寒保暖，保持猪圈通风干燥，坚持定期消毒，增加饲料营养，通过加强生物安全管理和饲养管理来降低猪群的发病率和死亡率。

总之，PDCoV、PEDV、TGEV和PRoV已成为当前猪群病毒性腹泻的主要病原，严重危害养猪业的健康发展，应进一步加强病原监测，做好疫苗免疫、饲养管理、生物安全等综合防控，持续降低猪群病毒性腹泻的发病率和死亡率。