不同处理方法制作的脂肪组织切片质量比较

刘小玲 张伟 赵洁

(1 中国人民解放军海军第971医院病理科，山东 青岛 266071； 2 青岛大学数字医学与计算机辅助手术研究院)

日常外科手术标本中有许多是含有脂肪组织的标本，在病理组织切片制作过程中，处理好脂肪组织，将会极大地提高切片质量，有利于疾病的正确诊断。但因脂肪组织内含有大量不溶于水的脂质[1]，这一特性使其在传统切片制作过程中很难完全置换出来，从而易产生组织破碎、积压、空洞、缺损等问题，严重影响切片质量，给医师诊断带来很大困难。而如果单独对脂肪组织额外进行脱水、透明、浸蜡等处理，则会增加切片处理的时间与成本。本研究通过对4种处理方法制作的脂肪组织切片的质量进行比较，探讨较为可行的脂肪组织切片制作方法。

1 材料与方法

1.1 标本与来源

收集2019年中国人民解放军海军第971医院病理科明确诊断的脂肪瘤组织、乳腺脂肪组织和胃、肠、子宫或肾脏器官根治切除术中的脂肪组织标本共298例。

1.2 仪器与试剂

ASP300S脱水机、EG1160包埋机(德国徕卡公司)以及HM315R切片机(赛默飞世尔科技中国有限公司)。

1.3 方法

标本均于离体2 h以内经体积分数0.04甲醛溶液固定24 h后[2]，并按照文献[3]的方法切成约2.0 cm×1.0 cm×0.1 cm大小的组织块4块，分为传统处理法组(A组)、延长浸蜡法组(B组)、丙酮脱脂法组(C组)和改良组织脱水处理流程法组(D组)4组。A组标本置于ASP300S全自动脱水机中进行脱水、透明、浸蜡处理，首先采用体积分数0.75、0.85、0.95、0.95、1.00、1.00、1.00乙醇溶液分别脱水90、90、60、60、60、45、45 min；其次采用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液分别透明30、30 min；最后采用石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ溶液分别浸蜡60、60、60 min。B组将标本首先按照A组方法进行处理后，浸蜡时间再延长8 h[4-5]。C组标本在脱水处理之前，先置于丙酮液中于封闭的振荡器中处理4 h，之后再按照A组方法进行处理[6-8]。D组标本在进行脱水处理过程中，脱水的试剂及作用时间更改为体积分数0.75、0.85、0.95、0.95、1.00、1.00乙醇溶液和体积分数1.00乙醇溶液与二甲苯(1∶1)混合液分别处理90、90、120、60、60、45和90 min[9]，后续的透明和浸蜡处理同A组。

将上述4组标本进行石蜡包埋后，采用轮转式切片机进行4 μm厚切片，然后40～42 ℃下于摊片机中摊片，70 ℃下烤片15 min[2]，最后进行常规苏木精-伊红(HE)染色，置于光学显微镜下观察。以临床技术操作规范切片质量分级标准对切片的质量进行评估[10]。

2 结 果

光学显微镜下观察显示，A组切片的优良率为40.9%(122/298)，切片存在破碎严重、脂肪细胞破裂、细胞核和细胞质对比不鲜明等问题(图1A)；B组切片优良率为43.0%(128/298)，切片的质量与A组相近(图1B)；C组和D组切片优良率分别为98.7%(294/298)和99.0%(295/298)，切片厚薄均匀、平整、无皱褶、无刀痕，且脂肪细胞结构完整，染色清晰，透明度好(图1C、D)。4组切片的优良率比较差异具有显著性(χ2=462.827，P<0.001)；C组与D组切片的优良率均显著高于A组与B组(χ2=223.666～238.973，P<0.001)；而A组与B组之间、C组与D组之间切片的优良率比较差异均无显著统计学意义(P>0.05)。

A～D分别为A组、B组、C组和D组，HE染色，10倍

3 讨 论

临床病理工作中常见脂肪组织标本，在切片制作过程中，处理好脂肪组织对提高切片质量和疾病正确诊断率具有重要意义。在脂肪组织切片传统处理流程中，对脂肪组织发挥脱脂作用的主要是高浓度的乙醇溶液[11]。但是乙醇溶液脱脂速度比较缓慢[12-13]，一般需要12 h以上才能脱脂完全[14]，但高浓度乙醇溶液实际处理的时间仅有4.5 h，只能置换出极少量脂肪组织；同时脂肪组织不溶于水，高浓度乙醇溶液不能置换出脂肪内的水分，也会影响脱水效果[15]。组织在脱水不彻底的情况下再采用二甲苯进行透明处理时，透明效果不佳[15]。在浸蜡处理过程中也不利于组织与石蜡之间的相互渗透[15]，最终造成制片困难。因此，以传统方法处理的脂肪组织标本，经脱水、透明和浸蜡处理后再进行切片时易出现破碎、散片现象，镜下观察时也会出现组织结构不清、细胞断裂的问题，从而影响对疾病的诊断[16]。

研究显示延长浸蜡法制作的切片完整性与传统方法相近[4]。但由于传统处理方法未能对标本中的脂肪组织完全溶解，致后期浸蜡效率降低，最后脂肪细胞呈现空泡状[4]，通过再增加8 h的浸蜡时间，以石蜡来支撑和填充空泡状的脂肪细胞，以达到保持其正常形态的效果[4]。

本研究中C组切片优良率较A组显著增高。丙酮有快速脱脂功能[5-7]，并可溶于水、醇、氯仿等试剂中，因此在脂肪组织脱水前先进行脱脂处理，提高了切片的质量。需要注意的是，丙酮脱脂法制作的切片质量好坏，主要取决于标本是否固定充分[17]。如果固定不充分就进行脱脂处理，则会导致脂肪组织变脆，切片时出现脂肪空泡破碎、摊片散片等现象，致使制片失败。

但在近期的大量研究中又发现，乙醇溶液只能使脂肪组织逐步渗透脱水，真正溶解脂肪组织的试剂是二甲苯[9]，因此有学者又提出改良脱水处理法[9]，即脂肪组织在脱水处理之后和透明处理之前，先以乙醇和二甲苯(1∶1)混合液进行处理。由于二甲苯不溶于水，所以将其置于脱水处理之后；同时二甲苯令脱水后的脂肪迅速溶解，从而促进了体积分数1.00乙醇溶液的渗透；体积分数1.00乙醇与二甲苯溶液协同交替作用，达到边脱水，边溶脂的功效。此种方法使得脂肪或有脂肪包裹的组织得到充分脱水与透明，亦保证了石蜡的有效浸透，使切片的完整性得到明显提高[9]，从而得到效果比较满意的切片。

本研究在此改良脱水处理的基础上，结合临床工作实践，对脱水处理流程又进行了调整。首先将体积分数1.00乙醇和二甲苯(1∶1)混合液由原来的45 和60 min两次处理更改为该混合液的一次处理90 min[9]，时间缩短了15 min；同时又增加了一次体积分数1.00乙醇和一次二甲苯的处理[18]，结果显示脱脂效果更好，切片优良率达到99.0%。

综上所述，丙酮脱脂法与改良脱水处理流程法制作切片优良率高于传统处理法和延长浸蜡法，易于疾病的病理诊断；但丙酮脱脂法试剂准备较为繁琐，而改良脱水处理流程法无需额外试剂准备，更省时省力，是一种非常实用的脂肪组织处理方法，值得在各医院推广、使用。