唾液腺腺样囊性癌组织特异性标记物的筛选及鉴定

王赛男 任皓 孙银银 李新 刘思宇 徐晓雨 卢恕来

(1 滨州市人民医院口腔科，山东 滨洲 256600； 2 大连医科大学口腔医学院；3 山东省立医院口腔科； 4 青岛大学附属青岛市市立医院口腔医学中心)

唾液腺腺样囊性癌(SACC)是一种源于上皮组织且具有独特生物学行为的恶性肿瘤，可发生在所有年龄阶段，中老年人群发病较多，无明显性别差异，具有易复发、常侵犯周围神经组织、易发生远处转移等临床特点[1]。早期患者常出现如感觉异常、麻木、疼痛及面瘫等神经受累症状，在口腔颌面部肿瘤中转移发生率较高,早期转移率高达40%[2]，而肺部是其晚期最常见的转移部位[3]。SACC对放化疗均不敏感,临床上主要通过手术切除的方式治疗,但是患者术后复发率、转移率均较高[4]，预后不佳。SACC的发病机制尚未明确，探究与SACC发生、发展密切相关的生物学标记物仍是目前临床研究的热点[5],一方面能够作为SACC诊断的筛检指标,可以早期发现患者，从而开展早期防治；另一方面,对探究疾病的发病机制和制定新的治疗方案均具有重要的指导意义[6]。

蛋白质组学是一种寻找肿瘤潜在生物标记物的稳定、准确、有效的方法。该学科以蛋白质组为研究对象，通过对正常及病理个体间的蛋白质组比较分析，找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，这些分子既可以作为新药设计的分子靶点，同时也是疾病早期诊断的分子标记物。当前蛋白质组学的核心技术为双向荧光差异凝胶电泳与质谱技术，通过双向荧光差异凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱技术对蛋白质逐一进行鉴定。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳与质谱技术比较SACC组织与癌旁正常腮腺组织中某些蛋白质表达水平的差异，为临床上寻找SACC早期诊断、治疗和监测预后的潜在生物标记物提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

本研究中所有组织标本均取自2018年1月—2019年8月于青岛市市立医院确诊为SACC的4例患者，其中男2例，女2例，平均年龄为46岁。肿瘤部位均位于腮腺，TNM分期分别为T2NXM0、T2N1M0、T3N1M0、T4aN1M0。手术过程中分别留取4例患者的癌组织及其癌旁正常腮腺组织标本。癌组织均经病理学检查以及免疫组化证实为SACC，癌旁正常腮腺组织为癌灶周围3 cm以外正常腮腺组织，也经病理证实无癌细胞浸润。按照世界卫生组织的标准进行组织病理学分类[7]。所有标本装入已标记好的冷冻管内，迅速放入液氮罐中，实验前转存-80 ℃低温冰箱备用。患者均签署了知情同意书；样本和临床资料收集遵循“赫尔辛基宣言”并经过青岛市伦理审查委员会批准(伦理批号：2018临审字第021号)。

1.2 试剂

Cydye2、Cydye3和Cydye5购于美国GE公司；二甲基甲酰胺购于美国Aldrich公司；等电聚焦电泳胶条购于美国Bio-Rad公司；Thiourea购于瑞士Fluka公司；蛋白酶抑制剂混合物购于美国罗氏公司；ACN和甲醇购于美国Fisher公司；TFA购于德国默克公司；胰蛋白酶购于美国普罗米加公司。

1.3 研究方法

1.3.1蛋白样本制备 将所有组织标本分别在液氮预冷的研钵中研磨成粉末，然后将粉末样本按照1∶10(W/V)加入组织裂解液，旋转混匀，超声震荡60 s，室温提取30 min，于4 ℃下以13 000 r/min离心20 min，小心收集上清液，避免取到上层脂肪层，分装后-80 ℃冻存。4例SACC组织和对应癌旁正常腮腺组织配对成4组样本。

1.3.2双向荧光差异凝胶电泳 每一组样本各取50 μg，分别加入0.1 mmoL/L Cydye5和Cydye3各0.5 μL，避光冰上标记2 h(4组样本中随机选取1组样本为反向标记)；内参样本取50 μg(25 μg SACC组织以及25 μg癌旁正常的腮腺组织)，以0.1 mmoL/L Cydye2 0.5 μL标记，避光冰上标记2 h。将所有样品加入10 mmoL/L赖氨酸1 μL中止标记。4 ℃下标记反应30 min后采用IPG胶条(pH 4～7,NL 24 cm)进行第1向等电聚焦电泳(IEF)。用Ettan DALT系统进行第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。标记和电泳后，用Typhoon 9410荧光扫描仪对凝胶进行扫描并获得3张胶的图片，为后续差异表达蛋白筛选做准备。用DeCyder 5.02软件将Cydye3及Cydye5凝胶图片叠加得到差异蛋白质点，差异蛋白点采用配对t检验进行定量比较，并对将胶上重复性较好差异表达蛋白质点进行胶内酶解(胰蛋白酶处理20 h)，提取酶解肽段。然后进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDL-TOF-MS)，并与NIST数据库进行匹配，完成蛋白质种类鉴定。

1.4 统计学方法

由DeCyder 5.02软件进行统计学分析，SACC组织及癌旁正常腮腺组织之间差异蛋白定量比较采用t检验，以两组蛋白含量比值(Average ratio)在1.5倍及以上，P<0.05表示差异有统计学意义，被认为是差异表达蛋白点。

2 结 果

通过荧光扫描仪对凝胶进行扫描后，得到样本中蛋白在胶图中的分布情况(图1)，白色的点代表没有差异表达蛋白点，红色和绿色的点代表SACC组织和癌旁正常腮腺组织有差异表达蛋白点。采用DeCyder 5.02软件将Cydye3和Cydye5凝胶图片叠加后显示有39个SACC组织和癌旁正常腮腺组织差异表达蛋白点(图2)，图中黄色标注的数字代表蛋白质编号；对39个差异表达蛋白点采用配对t检验进行定量比较，结果有24个表达上调(蛋白质编号为276、300、524、782、788、801、802、804、819、826、834、844、847、1213、1284、1318、1509、1518、1605、1607、1611、1625、2007)，15个表达下调(蛋白质编号为372、380、768、858、863、966、1202、1400、1407、1409、1419、1569、1797、1888、2103)；采用MALDL-TOF-MS质谱技术与NIST数据库匹配，荧光扫描后发现有5个差异表达蛋白点(蛋白质编号分别为834、1213、788、1509、1611)重复性较好，进一步进行质谱分析得到5种蛋白质，分别为α-淀粉酶1、葡萄糖调节蛋白(GRP)、蛋白二硫键异构酶(PDI)、LASP1蛋白以及PFN1蛋白，所有蛋白表达量均上调。

3 讨 论

大多数SACC组织中含基底样细胞巢，周围常有硬化的基底膜样物质环绕，细胞呈圆柱状，故又称为圆柱瘤或圆柱瘤型腺癌。SACC占唾液腺肿瘤的5%～10%，约占唾液腺恶性肿瘤的24%。国内对SACC及癌旁正常腮腺组织的蛋白质组学研究报道较少，本研究通过对SACC组织和癌旁正常腮腺组织进行了双向荧光差异凝胶电泳与质谱技术相结合的蛋白质组学分析，发现有39个差异蛋白质点，并鉴定出5种表达量上调、重复性好，且与SACC密切相关的蛋白质(α-淀粉酶1、GRP、PDI、LASP1以及PFN1)。

A：Cydye2标记的内参样本，波长488 nm；B：Cydye3标记的正常组织，波长532 nm；C：Cydye5标记的SACC组织，波长633 nm

图2 SACC组织和癌旁正常腮腺组织差异表达蛋白点

α-淀粉酶1是腮腺、下颌下腺及舌下腺中释放唾液的关键消化酶。在肺癌、肝癌、胰腺癌和唾液腺癌患者体内总血清淀粉酶量增高，可通过电泳技术进行检测[8]。患有浆细胞瘤的患者，其瘤浆细胞可直接产生唾液型淀粉酶，唾液型淀粉酶的表达升高可促进肿瘤的生长增殖[9]。本研究显示α-淀粉酶1在SACC组织中表达升高，提示α-淀粉酶1过表达可能促进了SACC的生长。

GRP是细胞在应激状态下表达的一类应激蛋白，其中GRP78属于热激性蛋白70家族的一员，细胞内质网中的GRP78在未折叠蛋白反应中发挥重要作用,能够保持内质网中钙离子平衡并抑制错误折叠蛋白的生成[10],是主要的内质网分子伴侣和应激诱发未折叠蛋白反应的标志蛋白,也是细胞维持正常功能的调节蛋白。GRP78在多数的正常组织中呈低表达,但是在肿瘤组织中的表达水平明显增高[11]，且GRP78的过表达能够促进肿瘤的生长、转移和耐药性[12-13]。研究表明，在胃癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌等多种癌组织中GRP78的表达情况与患者预后密切相关[14-18]。此外，有文献表明特异性下调GRP78的表达可以抑制人ACC细胞的侵袭和转移，而且该抑制作用可能与MMP和TIMP的表达有关[19]。本实验结果中SACC组织中GRP的表达水平明显高于癌旁正常腮腺组织，提示GRP在SACC发生、转移中发挥了重要的生物学作用。

PDI不仅在肿瘤组织中高表达，而且还与肿瘤侵袭和多种肿瘤类型的转移相关，如卵巢癌、前列腺癌、神经胶质细胞癌、乳腺癌，提示可作为肿瘤的诊断和预后评估的生物标记物[20]。PDI表达水平还可能与肝癌细胞的恶性生物学特性有关，表达水平越高提示肿瘤恶性程度越高[21]。本研究中PDI在SACC中高表达，表明PDI也可能是SACC诊断和预后评估的生物标记物。

LASP1蛋白是一种黏着斑蛋白，其特殊结构为细胞的迁移提供了条件[22]。LASP1蛋白在鳞状细胞癌组织中的表达明显高于癌旁正常腮腺组织，并且与淋巴结转移、肿瘤临床分期有关，而与肿瘤大小及肿瘤分化程度无关[23]。研究发现LASP1表达上调与乳腺癌、鼻咽癌、结肠直肠癌、非小细胞癌、胶质瘤细胞、口腔鳞癌、肾透细胞癌、胃癌及肝细胞癌的增殖关系密切[24-28]，并能增强肿瘤的侵袭能力。本研究结果显示，LASP1蛋白在SACC组织中的表达明显高于癌旁正常腮腺组织，提示LASP1蛋白可能参与SACC的形成过程。

PFN1不仅参与癌细胞转移，还参与了肿瘤血管形成过程，以往研究中发现，下调肺癌A549细胞中的PFN1能抑制细胞迁移并使A549细胞对抗癌药物敏感[29]。而在肝癌体外实验中，PFN1的过表达对肝癌细胞的增殖、迁移以及侵袭有明显的抑制作用[30]。在本实验中PFN1在SACC中高表达提示其可能与肿瘤的发生和发展有关。

总之，本研究中检测到的差异表达蛋白α-淀粉酶1、GRP、PDI、LASP1以及PFN1很可能是SACC潜在的组织特异性生物标记物，并且有可能成为临床上诊断或治疗的潜在靶点，这将为临床上该病的早期诊断及治疗提供新的思路和方法。