椴树蜜纯度鉴定及其抗氧化活性研究

张孟历，张宏武，贾红梅，于猛，王宝龙，邹忠梅*

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193；3.中国质量万里行促进会生态蜂业专业委员会，北京 100031）

蜂蜜是由蜜蜂科昆虫意大利蜜蜂（Apis mellifera Ligustica.）及中华蜜蜂（Apis cerana cerana Fabricius）吸收植物花粉，与自身分泌物结合后，在蜂巢中存放酿造而形成的天然甜物质[1-2]，是公认的具有多种生物活性的天然食品。蜂蜜作为药用历史悠久，始载于《神农本草经》，称蜂蜜为药中之上品，其中记载“蜂蜜味甘、平，无毒，主心腹邪气，诸惊痫痉，安五脏诸不足，益气补中，止痛解毒，除百病和百药。久服强志轻身，不饥不老，延年”[3-5]。

蜂蜜的品种常常由养蜂人根据蜂巢位置及其附近可用的花源进行主观判定，但对蜂蜜品种纯度关注不多[6-9]。蜂蜜的纯度直接影响蜂蜜的外观、口感及生物活性。应用现代分析技术如高效液相、核磁共振等可建立鉴别蜜源植物的方法，但花粉种类作为蜜源植物的判断依据[10-12]仍然是最直观的指标。蜜蜂采集花蜜的同时，也会采集到蜜源植物的花粉，而每一种植物花粉都有自己特有的形态特征，因此根据蜂蜜中的花粉种类和数量可以鉴定蜂蜜的种类和质量。通常认为“某种花的花粉率大于50%定义为该蜜源植物的单花蜜，小于50%则为杂花蜜或百花蜜”[13]。

椴树蜜是蜜蜂采集椴树属植物椴树[紫椴（Tilia amurensis Rupr.）、糠椴（Tilia mandshurica Rupr.et Maxim）等]花蜜酿造而成的蜜，主产于完达山脉、大兴安岭、小兴安岭、长白山脉及俄罗斯远东地区，作为我国东北地区的特色蜜种，产量大且营养价值高。纯正椴树蜜色白偏黄，口感细腻，具有治疗便秘、失眠、高血压、支气管炎等多种疾病的作用，也是肝脏疾病和神经衰弱症的良好辅助剂[14]。目前，对椴树蜜的研究不多，主要集中在成分与活性相关报道，有报道显示，椴树蜜中含有黄酮等酚类成分，并显示其有一定抗氧化活性[15-17]。但酚性成分含量、抗氧化活性是否与椴树蜜纯度具有相关性尚未见研究报道。因此，本文首先测定了来自东北地区且蜂农认定的椴树蜜中椴树花粉含量，鉴定椴树蜜的纯度，区分椴树单花蜜与椴树杂花蜜；通过福林酚法测定了椴树单花蜜与椴树杂花蜜总酚含量；并测定了椴树单花蜜与椴树杂花蜜的抗氧化活性，为椴树蜜质量评价及生物活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椴树蜜，2018年从我国东北地区8位蜂农处收集，共16批，详细资料见表1。

表1 椴树蜜样品来源信息表Table 1 Source information of linden honey

1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、总抗氧化能力检测试剂盒（2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基清除法，ABTS法）：Sigma公司；蒸馏水：屈臣氏；色谱甲醇（批号L-14834）：美国Fisher公司；甘油明胶（规格 10 mL，批号 20180925）：Solarbio公司；没食子酸（批号030002710001，纯度≥98%）：南京泽朗生物科技有限公司；无水碳酸钠（批号20180118）：北京市通广精细化工公司；福林酚试剂（批号SL28211620）：Coolaber公司；总抗氧化能力检测试剂盒（铁离子还原能力法，FRAP法）：碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

MSA125P-100-DU电子分析天平：德国SARTORIUS公司；KQ-500E超声振荡仪：昆山市超声仪器有限公司；Axio Observer D1显微镜：德国ZEISS公司；SUNRISE型酶标光度计：美国Tecan公司；UV-3100紫外-可见分光光度计：上海MAPADA公司。

1.3 方法

1.3.1 椴树蜜花粉含量的测定

椴树蜜花粉含量的测定参考张金振等[18]文献里的方法稍作改变。提取方法：将蜂蜜样品混匀后称取2 g椴树蜜，加水4 mL，混匀。2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，再加4 mL水，2 000 r/min离心10 min。小心倾出上清液后，沉淀加200 μL水混匀备用，待制片用。制片：在40℃的水浴中液化甘油明胶，同时将载玻片和盖玻片放置于40℃加热板上预热，分别吸取100 μL悬浊液于两块预热的载玻片上，将载玻片于40℃加热板上加热，直到载玻片的沉淀物完全干燥；于预热的盖玻片上滴一滴甘油明胶，使其在盖玻片对角形成一个大的十字，将盖玻片缓慢地盖在沉淀物上，以防止形成气泡。盖好盖玻片后稍稍加热，以保证甘油明胶均匀地分布并使花粉充分膨胀，在甘油明胶冷却凝固后进行显微镜观察分析。

1.3.2 椴树蜜总酚含量的测定

采用福林酚法测定椴树蜜中的总酚含量[19-20]。准确吸取没食子酸标准品贮备液（1.0 g/L）0、80、160、240、320、400、480、560 μL 分别置于 2 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混匀后待测。取各浓度没食子酸上清液0.5 mL与2.5 mL 0.2 mol/L福林酚溶液混合，5 min后加入100 g/L的碳酸钠溶液2 mL，加水定容至10 mL，反应2 h后（避光），以蒸馏水为空白对照，在760 nm下测定吸光度值。以没食子酸的量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取样品上清液0.5 mL与2.5 mL的0.2 mol/L福林酚溶液混合，5 min后加入100 g/L的碳酸钠溶液2 mL，用10 mL容量瓶定容，反应2 h后（避光），在760 nm条件下测定吸光度值。

1.3.3 椴树蜜DPPH自由基清除能力的测定

分别取 100 μL 的 10、25、40、55、70 g/L 的蜂蜜样品水溶液各加100 μL的0.05 g/L DPPH甲醇溶液（避光，现用现配）于96孔板中，室温（25℃）避光反应30 min，在517nm下测定吸光度记为A2；100μLDPPH甲醇溶液+100 μL蒸馏水与 100 μL甲醇溶液 +100 μL蜂蜜样品水溶液在上述条件下测得的吸光度值分别记为A1、A3。计算各样品对DPPH自由基的清除率。根据椴树蜜溶液浓度及清除率，通过GraphPad Prism 5软件，计算出IC50值。

1.3.4 椴树蜜ABTS+自由基清除能力的测定（ABTS法）

按照试剂盒内说明书提供的方法测定椴树蜜总抗氧化能力。按说明书方法配制各工作液，在96孔板中每孔依次加入：10μL各浓度Trolox标准液（0、0.015、0.045、0.105、0.21、0.42 mmol/L）或样品溶液 +20 μL 肌红蛋白工作液+150 μL ABTS工作液，5 min后各孔加入100 μL反应停止液，于405 nm测定吸光度。

1.3.5 椴树蜜铁离子还原能力的测定[（ferric reducing antioxidant power，FRAP）]

按照试剂盒内说明书提供的方法测定椴树蜜总抗氧化能力。按说明书方法配制各工作液，在96孔板中每孔加入：180 μL FRAP工作液+5 μL蒸馏水或各浓度 FeSO4标准液（0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L）或样品溶液。37℃孵育5min后于593nm测定吸光度。

1.3.6 数据处理

有数据经excle和Graphpad Prism 5软件进行数据统计和图表制作，试验结果以均数±标准差（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 椴树蜜纯度测定

显微镜下观察花粉形态，椴树花粉特征明显，见图1。

图1 椴树花粉显微镜下形态（×400）Fig.1 The morphology for linden pollen under the microscope（×400）

从图1中可以看出椴树花粉外观呈圆形至椭圆状态，圆内可见一类三角形图案，特征明显，与文献[18]报道一致。而其余花粉或呈圆形，内部布满小点，或外观呈三角形，与椴树蜜花粉区别明显。通过对16批椴树蜜分别进行观测，结果见表2。

由表2可知，发现所有样品中均能观察到椴树花粉的存在，说明均为椴树蜜。但所含椴树花粉占总花粉的量不同，从7.14%～76.73%不等，表明其所含椴树蜜的纯度差异较大。依据文献[13]，其中7批次的椴树蜜中椴树花粉率大于50%，可判定为椴树单花蜜，其他批次椴树花粉率小于50%，判定为椴树杂花蜜。

2.2 椴树蜜总酚含量

根据试验结果以没食子酸量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制的标准曲线方程为y=0.011x+0.023 9（R2=0.999）（图 2）。

表2 各批次椴树蜜花粉含量测定结果（n=3）Table 2 Determination of pollen content of each batch of Linden honey（n=3）

图2 没食子酸标准曲线图Fig.2 The standard curve for gallic acid

椴树蜜总酚含量以相对没食子酸的量表示，详细结果见表3。表3结果显示椴树蜜总酚含量以没食子酸计在 174.64 μg/g ～329.18 μg/g，总酚含量最高的为 2 号椴树蜜，为329.18 μg/g，其次为8号椴树蜜，总酚含量最低为4号椴树蜜，为174.64μg/g，其中椴树单花蜜总酚含量为 174.64 μg/g ～222.82 μg/g，椴树杂花蜜总酚含量为 223.73 μg/g ～392.18 μg/g。椴树杂花蜜总酚含量稍低于单花蜜，但不具有显著差异。

2.3 椴树蜜对DPPH自由基的清除作用

16批椴树蜜对DPPH自由基均有不同程度的清除作用，且清除率随样品浓度的增加而增强。由表3可知，各批次椴树蜜DPPH自由基清除率IC50值在（24.72±6.89）g/L ～（107.76±34.17）g/L 之间，其中椴树单花蜜 IC50值为（46.61±10.91）g/L ～（107.76±34.17）g/L，椴树杂花蜜 IC50值为（24.72±6.89）g/L ～（76.75±8.09）g/L，没有显著区别。与文献[17]报道的椴树蜜DPPH清除率IC50值35.35 mg/mL～87.93 mg/mL基本吻合。

表3 各批次椴树蜜抗氧化能力及总酚含量测定结果Table 3 Determination of antioxidant capacity and total phenolic content of all selected samples of Linden honey

2.4 椴树蜜对ABTS+自由基的清除能力

标准曲线图见图3。

图3 标准曲线图Fig.3 The standard curve

以Trolox浓度（mmol/L）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制的标准曲线方程为y=-1.479 7x+1.044 9（R2=0.992 9）（图 3A）。以 Trolox计，16批椴树蜜 ABTS+自由基的清除能力为 （0.14±0.07）mmol/kg ～（0.56±0.04）mmol/kg，其中椴树单花蜜ABTS+自由基的清除能力为（0.14±0.07）mmol/kg ～（0.43±0.10）mmol/kg，椴树杂花蜜ABTS+自由基的清除能力为（0.25±0.01）mmol/kg ～（0.56±0.04）mmol/kg，详细结果见表 3。

2.5 椴树蜜的铁离子还原能力

以FeSO4浓度（mmol/L）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制的标准曲线方程为y=0.311 9x+0.048 4（R2=0.9999）（图3B）。以FeSO4计16批椴树蜜铁离子还原能力为（1.96±0.08）mmol/kg ～（3.81±0.11）mmol/kg，其中椴树单花蜜铁离子还原能力为（1.96±0.08）mmol/kg ～（2.82±0.08）mmol/kg，椴树杂花蜜铁离子还原能力为（2.08±0.07）mmol/kg ～（3.81±0.11）mmol/kg，详细结果见表3。

3 结论

收集的16批样品为蜂农认定的椴树蜜，均检测到椴树花粉，但花粉测定结果显示椴树花粉含量差异较大，从7.14%到76.73%不等，因此，可根据椴树花粉含量判断椴树蜜的纯度，以区分椴树单花蜜与杂花蜜。结果表明，其中7批椴树蜜中椴树花粉含量大于50%，定义为椴树单花蜜；9批椴树花粉含量小于50%，定义为椴树杂花蜜。本文还对各批次椴树蜜的总酚含量进行了测定，总酚含量以没食子酸计在174.64 μg/g ～329.18 μg/g，与文献报道结果基本一致，其中椴树单花蜜总酚含量为 174.64 μg/g ～222.82 μg/g，椴树杂花蜜总酚含量为223.73 μg/g ～329.18 μg/g，二者差异不大。大量研究表明总酚含量与抗氧化活性存在一定的关系[21-22]，一般来说总酚含量越高，其抗氧化活性越好。采用DPPH法、ABTS法及FRAP法3种方法对椴树蜜的抗氧化能力进行了评价，结果显示，所有批次椴树蜜均具有一定抗氧化作用，抗氧化活性与其总酚含量呈正相关，但单花蜜与杂花蜜的抗氧化能力差异不大，表明椴树蜜抗氧化活性与椴树蜜纯度相关性不强。