白内障患者NOS、DPP及TFAR19蛋白的表达及临床意义

张红振 王二丽 朱乐如

白内障为世界致盲疾病之首，随着我国人口老龄化加剧，白内障患病率逐年升高。如何防治白内障，保护白内障按患者视力成为眼科医生研究的热点。既往研究表明，自由基氧化损伤会加重晶状体氧化损伤程度，但其对白内障患者影响的相关研究结果尚未完善［1-2］。二肽基肽酶（DIPEPTIDYL peptidase，DPP）在细胞死亡及蛋白降解中发挥重要作用，有学者研究指出先天性白内障大鼠晶状体中DPP 的表达会明显高于正常对照组大鼠，且晶状体浑浊程度更高［3］。凋亡相关蛋白19（apoptosis-associated protein19，TFAR19）已被较多学者证实与细胞凋亡关系密切，但其与白内障发病机制之间的关系鲜有报道［4-5］。本研究将深入探讨白内障患者外周血中NOS、DPP 及TFAR19蛋白的表达情况及临床意义，为临床诊治白内障提供理论依据。现研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月至2018年5月本院收治的64例白内障患者的临床资料进行整理、分析。纳入标准：①均为初次确诊为白内障的患者，年龄在52～78 岁之间；②纳入研究之前未进行白内障摘除术或其他药物治疗；③均在入院后行白内障囊外摘切除术。排除标准：①合并青光眼、高度近视、眼外伤等其他眼部疾病者；②代谢性白内障、过熟期白内障患者；③糖尿病病程长达5年的患者；④精神障碍无法配合治疗者。

根据纳入排除标准，本研究最终纳入符合标准的64 例白内患者设为观察组。其中男38 例，女26 例；平均年龄（60.41±2.58）岁；皮质性白内障26例，核性白内障20 例，后囊下性白内障18 例，健康组中男34 例，女30 例，平均年龄（60.21±2.47）岁。另选上述患者除去病变部位外的正常组织为对照组。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者知情并签署同意书。

1.2 方法

两组均于入院或次日清晨空腹抽取静脉血4 mL，4℃保存，自然凝固后以3 000 r/min 离心10 min，分离血清标本，-20℃冰箱保存备用。以酶联免疫吸附法检测血清中NOS 水平。试剂盒由上海江莱食物科技有限公司提供，检测仪器为美国产的ELX808 酶标仪。

以免疫组化化学SP 染色测定DPP、TFAR19蛋白水平，兔抗人多克隆抗体DPP 及TFAR19 由美国Beckman Coulter 公司提供。将摘除眼球后极部巩膜组织常规石蜡切片，梯度水化，抑制内源性过氧化物酶修复，4℃室温孵育过夜，PBS 洗涤，滴加辣根过氧化物酶标记物，PBS 洗涤，DAB 显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察DPP、TFAR19。

1.3 判断标准

DPP 及TFAR19 蛋白阳性判断标准［6］：肿瘤细胞胞质或细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒。阳性细胞占比：0 分（无阳性，无色）；小于30.00%（1分，淡黄色）；大于等于30.00%（2 分，棕黄色），3 分（棕褐色）。阳性细胞所占百分比小于26%为1 分，阳性细胞所占百分比26%～50%为2 分，阳性细胞所占百分比51%～75%为3 分，阳性细胞壁大于75%为4 分；根据两者相乘结果进行评判：小于3分（-）、3 分（+）、4 分（++）、5 分（+++）。阳性率=阳性例数/总例数×100%。

1.4 观察指标

①对比观察组与对照组血清NOS 水平及DPP、TFAR19 蛋白表达情况，并分析白内障组NOS、DPP、TFAR19 的表达与患者临床特征之间的关系。②观察患者术后视力恢复情况，以术后3 个月视力结果为标准，依据视功能问卷（visual function，VF）［7］评估患者术后视力恢复情况。该问卷包括主观视觉、周边视野、视觉适应、立体视觉4 个指征，依据患者主观感觉从无困难到严重困难分为4级，得分1～4 分，总分0～100 分。视力正常或接近正常：VF 评分大于等于60 分；视力损伤：VF 评分在60 分以下。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；影响患者视力预后的相关因素采用非条件单因素和多因素Logistic回归分析；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NOS、DPP及TFAR19在两组中的表达情况比较

观察组NOS 水平、DPP 及TFAR19 阳性表达率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 NOS、DPP 及TFAR19 在两组中的表达情况［（n）%，（±s）］Table 1 Comparison the expressions of NOS，DPP and TFAR19 in the two groups［（n）%，（±s）］

表1 NOS、DPP 及TFAR19 在两组中的表达情况［（n）%，（±s）］Table 1 Comparison the expressions of NOS，DPP and TFAR19 in the two groups［（n）%，（±s）］

组别观察组对照组t/χ2值P 值n 64 64 NOS（ng/mL）1.58±0.30 1.23±0.22 7.526 0.001 DPP阳性46（71.88）14（21.87）32.125 0.001阴性18（28.12）50（78.13）TFAR19阳性40（62.50）18（28.12）15.259 0.001阴性24（37.50）46（71.88）

图1 免疫组化染色图（SP，×500）Figure 1 Immunohistochemical staining（SP，×500）

2.2 NOS、DPP 及TFAR19 表达与白内障患者临床特征的相关性

NOS、DPP 及TFAR19 的表达与白内障患者年龄呈显著正相关（P＜0.05），与患者性别、不同类型、合并糖尿病、合并高血压之间无显著相关性（P＞0.05）。见表2。

2.3 影响白内障患者术后矫正视力预后的单因素分析

通过分析影响白内障患者术后矫正视力预后的单因素，发现：性别、不同类型、合并高血压为非影响白内障患者术后视力预后的单因素（P＞0.05）；年龄、合并糖尿病、NOS、DPP、TFAR19为影响患者术后矫正视力预后的单因素（P＜0.05）。见表3。

表2 NOS、DPP 及TFAR19 表达与白内障患者临床特征的相关性Table 2 Correlation between expression of NOS，DPP and TFAR19 and clinical features of cataract patients

表3 影响白内障患者术后矫正视力预后的单因素分析Table 3 univariate analysis on the prognosis of postoperative corrected visual acuity in cataract patients

2.4 影响白内障患者术后视力预后的多因素分析

选取有条件的单因素经非条件多因素Logistic回归模型进一步分析，得出：年龄（≧65 岁）、NOS表达（高水平）、DPP 表达（阳性）、TFAR19 表达（阳性）影响白内障患者术后视力预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响白内障患者术后视力预后的多因素分析Table 4 multivariate analysis of visual acuity prognosis in cataract patients

3 讨论

白内障为老化、遗传、环境等因素引起的晶状体代谢紊乱，晶状体蛋白变形而变浑浊，严重影响患者的视力，该病的发生及发展的确切机制至今尚未明确。相关研究结果表明，白内障的发生与晶状体氧化损伤之间联系密切，其中以自由基对晶状体的损伤最为严重［8］。但由于直接检测患者机体内的自由基较为困难，NOS 为促进自由基合成的限速酶，临床多采用检测NOS 来间接反映自由基含量［9］。本研究采用酶联免疫吸附法测定血清中NOS，并使用免疫组化化学染色的方法检测DPP、TFAR19，分析其与患者临床特征及术后视力预后之间的关系。

有学者研究报道NOS 在眼部脉络膜、睫状体、视网膜等各个组织均有表达，但正常生理情况下呈低表达状态［10］。本研究结果显示，观察组NOS水平高于对照组，DPP 及TFAR19 阳性表达率明显高于对照组，这一研究结果与既往文献报道结果相似［11］。既往文献报道，白内障患者晶状体中的NOS 表达会高于无眼部疾病者［12］。NOS 参与正常生理状态下自由基的合成，在机体处于病理状态时，可受内毒素、白细胞介素-1 等介质刺激，产生大量一氧化氮合酶，生成过量的自由基并发挥细胞毒效应［13］。本研究结果进一步证实，白内障患者NOS 的过度表达与白内障病变相关。DPP 是定位于囊泡系统的细胞内溶酶体蛋白酶，早期有学者报道，从猪、大鼠等动物的晶状体中检测出DPP［14］。Herman 等［15］指出，DPP 存在于啮齿动物的晶状体中。XU 等［16］采用免疫组化染色法，检测到DPP 存在有睫状体无色素上皮细胞、晶状体上皮细胞、晶状体纤维层等结构中，由此推测DPP 的表达与白内障的发生有关。TFAR19 是最早由北京大学发现的一种与细胞凋亡关系密切的蛋白质，存在于人体50 多种组织，是参与细胞凋亡和抑制细胞生长过程的重要蛋白质。

本研究通过分析NOS、DPP、TFAR19 与患者临床特征的关系，发现年龄与白内障患者上述指标的表达有显著相关性。考虑为年纪越大的患者机体老化程度加速及局部营养障碍严重，会加大白内障的发生几率，从而刺激NOS、DPP、TFAR19表达。但由于本研究已排除合并糖尿病病程长达五年的患者，因此在本研究中合并糖尿病仅为影响白内障患者手术矫正视力预后的单因素而非独立危险因素，代谢性疾病对白内障患者术后视力预后的影响还有待进一步深入研究。

综上所述，NOS、DPP、TFAR19 在白内障患者中呈高表达，NOS、DPP、TFAR19 表达与患者年龄有密切联系，上述指标表达过高会影响患者手术矫正视力预后。但由于本研究纳入样本量较少，且未进行其前瞻性研究，实验结果难免存在偏倚，相关指标的表达与白内障发生、进展及预后的关系尚需进一步研究。