VEGF-C与Gas6在胆管癌中的表达及临床意义

朱宇 吴涯昆 龚程 庞武 田银生

胆管癌属于临床常见恶性肿瘤，因解剖组织结构关系复杂、缺乏特异性肿瘤标志物导致早期诊断困难，随着病情进展，易发生纵向跳跃式转移与横向浸润转移，对预后产生严重不利影响［1-2］。因此，探索影响胆管癌肿瘤细胞侵袭、转移的病理因子意义重大。血管内皮生长因子C（Vascular endothelial growth factor C，C）是一种血管生长因子，参与血管生成过程，能加快细胞侵袭、转移，促使病情恶化［3］。生长停滞特异性基因6（Growth arrest specific gene 6，Gas6）是生长停滞特异性基因家族重要成员，也是维生素K 依赖性生长促进因子，能结合相应配体，通过特定信号通路参与肿瘤血管生成、分化、转移、凋亡等过程［4］。既往虽有研究分析两者在胆管癌中的相关机制，但关于两者之间关系及对生存状况的影响尚未见报道。为此，本研究尝试分析VEGF-C 与Gas6 在胆管癌中的表达及临床意义，旨在为临床提供数据支持。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2016年5月至2019年8月122 例胆管癌患者作为研究对象，其中男82 例，女40 例，平均（57.74±6.21）岁，肿瘤直径2.0～5.0 cm，平均（3.72±0.36）cm，肿瘤部位：中下段胆管50 例，肝门及肝内胆管72 例，临床分期：Ⅰ期15 例，Ⅱ期36例，Ⅲ期40 例，Ⅳ期31 例，动静脉受侵39 例，未受侵83 例，淋巴结转移78 例，未转移44 例。本研究经本院伦理委员会审批通过。

纳入标准：①均经手术病理检查证实为胆管癌；②临床分期Ⅰ～Ⅳ期；③术前均未接受放化疗等相关抗肿瘤治疗；④临床资料完整；⑤患者及家属均知情本研究，签订知情承诺书。排除标准：①合并其他肿瘤者；②伴有感染性、炎症性疾病者；③血液系统异常者；④属于复治或肿瘤复发患者；⑤术前接受抗肿瘤治疗者。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-C、Gas6 检测方法

采用免疫组织化学法检测癌组织、癌旁正常组织（距癌组织切缘0.5 cm 左右，经病理检查证实为非癌组织）中VEGF-C、Gas6 表达情况，将石蜡包埋组织采用组织切片机连续切开（厚度为4 μm），对石蜡切片行脱腊、水化处理，高温修复5 min，过氧化氢溶液（3%）室温孵育，共10 min；PBS 冲洗5 min，滴加山羊血清，室温放置30 min，滴加兔抗人VEGF-C、Gas6 多抗，湿盒内4℃过夜。PBS 冲洗，滴加二抗，于常温条件下反应15 min，DAB 显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，封固。采用PBS 替代一抗作为阴性对照组，已知阳性片作为阳性对照。

1.2.2 VEGF-C、Gas6 结果判读

Gas6 在胞浆及胞核中可见棕黄色颗粒为阳性，VEGF-C 在胞浆中可见棕黄色颗粒为阳性。由2 名经验丰富的病理医师共同阅片。采用半定量积分判定阅片结果。采用H-Score 评分系统判定结果，阳性细胞计数与染色强度2 项积分相乘，＜4分判定为阴性，≥4 分为阳性。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，用t检验，计数资料以n（%）表示，用χ2检验，Kaplan-Meier 曲线进行生存分析，采用Log-rank 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清VEGF-C、Gas6 阳性表达率比较

癌组织中VEGF-C、Gas6 阳性表达率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。VEGF-C、Gas6 免疫组化。见图1。

表1 两组血清VEGF-C、Gas6 阳性表达率比较［n（%）］Table 1 Comparison of Positive expression rates of VEGF-C and Gas6 of 2 groups［n（%）］

2.2 VEGF-C 与胆管癌临床特征相关性

VEGF-C 与动静脉受侵、淋巴结转移、临床分期、Gas6 呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

图1 VEGF-C、Gas6 免疫组化图Figure 1 immunohistochemistry of VEGF-C

2.3 Gas6 与胆管癌临床特征相关性

Gas6 与动静脉受侵、淋巴结转移、临床分期、VEGF-C 呈正相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 多元线性逐步回归分析

将年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、组织学分级、病理类型等因素控制后，VEGF-C、Gas6 仍与动静脉受侵、淋巴结转移、临床分期显著相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 胆管癌患者1年生存率

随访1年，失访8 例。114 例胆管癌患者1年生存率为65.79%（75/114）。

2.6 生存分析

Kaplan-Meier 曲线分析，VEGF-C、Gas6 阳性表达患者1年生存率低于阴性表达患者（χ2=3.933、6.341，P=0.012、0.041），见图4。

表3 Gas6 与胆管癌临床特征相关性［n（%）］Table 3 Correlation between Gas6 and clinical features of cholangiocarcinoma［n（%）］

表4 多元线性逐步回归分析Table 4 Multiple linear stepwise regression analysis

图4 生存曲线Figure 4 Survival curve

3 讨论

胆管癌是发生于肝外胆道至肝门区、胆管下端的恶性肿瘤，相关数据统计显示，其多见于50～70 岁群体，男性多于女性，发病呈现逐渐升高趋势，占肝内外胆道中的60%左右，且5年生存率较低，防治形势较为严峻［5-6］。故临床需通过探索相关因子改变为寻找新型治疗途径提供依据，以强化疗效，延长生存期。

VEGF-C 是血管内皮生长因子之一，在多种恶性肿瘤血管形成中发挥重要作用，与肿瘤发生、发展关系密切［7］。冯瑶瑶等［8］报道显示，VEGF-C 通过结合特异性受体诱导淋巴管内皮细胞及血管生成参与宫颈癌侵袭转移过程。在此基础上，本研究发现，VEGF-C 在胆管癌中呈高表达状态，对肿瘤侵袭、转移产生重要影响，与戚诚等［9］研究结果相符。分析原因，VEGF-C 可结合并激活血管内皮生长因子受体（VEGFR）-3，经由磷脂酰肌醇3 激酶（P13K）/蛋白激酶B（Akt）、丝裂原细胞外激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）等信号通路途径，刺激、加快淋巴管内皮细胞有丝分裂及增生，从而引发淋巴结转移［10］。且VEGF-C 促进肿瘤新生血管形成过程中，随着肿瘤细胞不断增殖，侵袭周围动静脉。可见下调VEGF-C 表达可能是控制胆管癌肿瘤侵袭、转移的重要环节。

Gas6 属于多功能域构架蛋白，在人体多种组织器官中广泛表达，相关研究指出，Gas6 可通过结合TAM 家族成员Axl，发挥调节细胞黏附、增殖、凋亡等多种功能［11］。既往有文献显示，Gas6 在卵巢癌、肺腺癌、口腔鳞癌等恶性肿瘤中呈现高表达趋势［12］。王子伟等［13］观点认为，Gas6 可作为反映胆管癌恶性程度的指标之一。本研究结果证实，Gas6 在胆管癌中不仅呈高表达状态，还与病理改变关系密切。主要是由于Gas6 可通过信号转导与转录激活因子1（STAT1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、P13K/Akt 等多种信号途径，影响肿瘤细胞血管形成、增殖、迁移及凋亡［14］。同时，Gas6 表达水平越高，肿瘤细胞侵袭、转移可能性越大，不断促进疾病恶化，从而提高预后不良风险，缩短生存期。故Gas6 有望成为肿瘤标志物，为临床诊治胆管癌提供新方向。

综上可知，VEGF-C 与Gas6 在胆管癌组织中表达密切相关，均与动静脉受侵、淋巴结转移、临床分期显著相关，联合检测有助于为临床评估病情、预测生存状况提供参考依据。但本研究受样本量及检测方法的限制，仍需进一步明确VEGF-C与Gas6 在胆管癌中的协同作用机制。