miR-766-3p调控肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的分子机制

郭喜喜 王振华 胡红军 张立国

肺癌是临床常见恶性肿瘤之一，调查研究显示，肺癌发病率与死亡率逐年上升，其中非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型，由于肺癌早期诊断准确率较低导致大部分患者确诊时已处于中晚期［1-2］。因而寻找早期诊断肺癌的分子标志物具有重要意义。miRNA 在肺癌组织及细胞系中异常表达，并可影响肿瘤发生发展进程［3-4］。miR-766-3p在肝癌、肾癌中低表达，上调miR-766-3p 的表达可抑制肿瘤进展［5-6］。TargetScan 预测显示KIFC1 可能是miR-766-3p 的靶基因，研究表明KIFC1 在肺癌组织中上调表达，并可参与肺癌发生过程［7］。但miR-766-3p 是否可通过调控KIFC1 的表达从而参与肺癌发生发展过程尚未可知。本研究主要通过上调miR-766-3p 的表达分析其对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，探究其对KIFC1 的调控作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2017年10月至2018年10月本院收治的25 例肺癌患者为研究对象，所有患者均经病理证实为肺癌，其中男15 例，女10 例，年龄为56～70 岁，平均年龄为（63.38±6.15）岁，所有患者均接受手术治疗，术前均未接受放疗或化疗，于术中切除肺癌组织及癌旁组织（＞5 cm）标本，置于液氮中保存，术后转移至-80℃超低温冰箱保存。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.2 材料与试剂

肺癌细胞A549 购自美国ATCC 细胞库。miR-766-3p mimics、miR-NC、anti-miR-766-3p、anti-miRNC、si-KIFC1、si-NC 购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、SYBR Green 试剂盒购自日本TaKaRa 公司；MTT 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；Mgtrigel 基质胶购自美国BD 公司；双荧光素酶报告基因载体购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、P21、E-cadherin 抗体购自美国CST 公司；兔抗人KIFC1 抗体购自上海允麦生物科技有限公司；HRP 标记的山羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染及实验分组

A549 细胞接种于24 孔板，分别将miR-NC、miR-766-3p mimics、si-NC、si-KIFC1、anti-miR-NC、anti-miR-766-3p、miR-766-3p mimics 与pcDNA3.1、miR-766-3p mimics 与pcDNA3.1-KIFC1 转 染 至A549 细胞，分别记作miR-NC 组、miR-766-3p 组、si-NC 组、si-KIFC1 组、anti-miR-NC 组、anti-miR-766-3p 组、miR-766-3p+pcDNA3.1 组、miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 组。

1.3.2 qRT-PCR检测细胞中miR-766-3p的表达水平

采用Trizol 法提取肺癌组织、癌旁组织及A549 细胞总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板，参照SYBR Green 试剂盒配置qRT-PCR 反应体系，计算miR-766-3p 相对表达量。

1.3.3 肺癌组织中KIFC1 蛋白阳性表达

制备肺癌组织石蜡切片，在不同浓度乙醇中脱水后放置在柠檬酸盐溶液中20 min，PBS 清洗后，滴加3%过氧化氢溶液室温下反应25 min，PBS清洗后，滴加山羊血清反应15 min，加入稀释后的KIFC1 一抗，放置4℃冰箱中过夜，PBS 清洗，加入二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，室温下反应2 h，加入DAB 显色液进行显色反应，苏木素复染，在不同浓度的乙醇中进行脱水处理，滴加二甲苯，中性树脂进行封片，置于显微镜下进行观察。

1.3.4 MTT 检测细胞增殖

收集各组对数生长期A549 细胞（3×104个/mL）接种于96 孔板（100 μL/孔），分别于转染24、48、72 h 时每孔中加入20 μL MTT 溶液，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，匀速振荡10 min，应用酶标仪检测各孔光密度值（OD 490 nm）。

1.3.5 Transwell 实验检测细胞迁移与侵袭

细胞迁移实验：取对数生长期A549 细胞（5×104个/mL）加入上室（200 μL/孔），下室加入DMEM 培养液（600 μL/孔），培养24 h，多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，观察迁移细胞数。细胞侵袭实验：预冷培养液稀释Matrigel 基质胶后加入上室（40 μL/孔），孵育5 h，后续步骤同细胞迁移实验。

1.3.6 双荧光素酶报告基因检测

TargetScan 预测显示KIFC1 的3′UTR 区存在miR-766-3p 的结合位点，构建含有结合位点的野生型载体WT-KIFC1，构建含有突变位点的突变型载体MUT-KIFC1，取对数生长期A549 细胞，WT-KIFC1、MUT-KIFC1 分别与miR-766-3p mimics、miR-NC 共转染至A549 细胞，参照Lipofectamine2000 试剂说明书进行转染，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3.7 Western blot 检测Cyclin D1、MMP-2、P21、E-cadherin 蛋白表达

取各组A549 细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，经SDS-PAGE分离蛋白（30 μg 蛋白上样量），转膜，封闭2 h，孵育一抗稀释液（1∶1 000），4℃孵育过夜，孵育二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h，显影，定影，应用ImageJ 软件分析各条带灰度值。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以（±s）表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-766-3p、KIFC1 在癌旁组织和肺癌组织中的表达

与癌旁组织相比，肺癌组织中miR-766-3p 的表达水平［（1.05±0.10）vs（0.24±0.02）］显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），KIFC1 蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 肺癌和癌旁组织的病理图（HE，×200）Figure 1 Pathological features of lung cancer and normal tissues（HE，×200）

2.2 过表达miR-766-3p 对细胞A549 增殖、迁移、侵袭的影响

与miR-NC 组比较，miR-766-3p 组A549 细胞活力及Cyclin D1、MMP-2 蛋白表达量显著降低，迁移与侵袭细胞数显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表1、表2。

表1 过表达miR-766-3p 对细胞A549 增殖的影响（±s）Table 1 Effects of overexpression of miR-766-3p on proliferation of A549 cells（±s）

表1 过表达miR-766-3p 对细胞A549 增殖的影响（±s）Table 1 Effects of overexpression of miR-766-3p on proliferation of A549 cells（±s）

注：与miR-NC 组比较，aP＜0.05。

分组miR-NC miR-766-3p t 值P 值n 9 9 miR-766-3p 0.22±0.02 0.81±0.08a 21.464 0.000 Cyclin D1 0.74±0.07 0.24±0.02a 20.604 0.000 P21 0.15±0.01 0.63±0.06a 23.674 0.000细胞活性（490 nm）24 h 0.46±0.04 0.27±0.03a 11.400 0.000 48 h 0.78±0.08 0.38±0.04a 13.416 0.000 72 h 1.03±0.10 0.47±0.05a 15.026 0.000

图2 过表达miR-766-3p 对细胞A549 增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响Figure 2 Effects of miR-766-3p overexpression on proliferation，migration and invasion protein expression of A549 cells

表2 过表达miR-766-3p 对细胞A549 迁移、侵袭的影响（±s）Table 2 Effects of overexpression of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

表2 过表达miR-766-3p 对细胞A549 迁移、侵袭的影响（±s）Table 2 Effects of overexpression of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

注：与mir-nc 组比较，aP＜0.05。

分组miR-NC miR-766-3p t 值P 值n9 9 E-cadherin 0.23±0.02 0.82±0.08a 21.464 0.000 MMP-2 0.85±0.08 0.32±0.03a 18.610 0.000迁移细胞数150±15.2 66±6.83a 15.122 0.000侵袭细胞数139±14.1 58±6.21a 15.772 0.000

2.3 miR-766-3p 靶向、调控KIFC1

TargetScan 预测显示KIFC1 的3′UTR 含有miR-766-3p 的互补序列，见图3。miR-766-3p 过表达可降低WT-KIFC1 的荧光素酶活性（P＜0.05），而对MUT-KIFC1 荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05）。miR-766-3p 过表达可降低KIFC1 蛋白水平（P＜0.05），抑制miR-766-3p 表达可提高KIFC1 蛋白水平（P＜0.05）。

图3 miR-766-3p 和KIFC1 的互补序列Figure 3 miR-766-3p targets and regulated KIFC1

2.4 抑制KIFC1 对细胞A549 增殖、迁移、侵袭的影响

与si-NC 组比较，si-KIFC1 组A549 细胞活力及Cyclin D1、MMP-2 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），迁移与侵袭细胞数显著减少（P＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表达量显著升高（P＜0.05），见表3、表4。

表3 抑制KIFC1 对细胞A549 增殖的影响（±s）Table 3 Effects of KIFC1 inhibition on proliferation of A549 cells（±s）

表3 抑制KIFC1 对细胞A549 增殖的影响（±s）Table 3 Effects of KIFC1 inhibition on proliferation of A549 cells（±s）

注：与si-NC 组比较，aP＜0.05。

分组si-NC si-KIFC1 t 值P 值n 9 9 KIFC1 0.85±0.08 0.40±0.04a 15.094 0.000细胞活性（490 nm）Cyclin D1 0.72±0.07 0.31±0.03a 16.151 0.000 P21 0.13±0.01 0.50±0.05a 21.769 0.000 24 h 0.47±0.04 0.32±0.03a 9.000 0.000 48 h 0.79±0.08 0.43±0.04a 12.075 0.000 72 h 1.05±0.10 0.56±0.05a 13.148 0.000

表4 抑制KIFC1 对细胞A549 迁移、侵袭的影响（±s）Table 4 Effects of KIFC1inhibition on migration and invasion of A549 cells（±s）

表4 抑制KIFC1 对细胞A549 迁移、侵袭的影响（±s）Table 4 Effects of KIFC1inhibition on migration and invasion of A549 cells（±s）

分组siNC si-KIFC1 t 值P 值n 9 9 E-cadherin 0.22±0.02 0.68±0.07a 18.956 0.000 MMP-2 0.84±0.08 0.45±0.04a 13.081 0.000迁移细胞数152±15.2 76±7.63a 13.406 0.000侵袭细胞数142±14.1 69±7.11a 13.869 0.000

2.5 过表达KIFC1 能逆转miR-766-3p 对细胞A549 增殖、迁移、侵袭的抑制作用

相较于miR-766-3p+pcDNA3.1 组，miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 组细胞活力及Cyclin D1、MMP-2 蛋白表达量显著升高（P＜0.05），迁移与侵袭细胞数显著增加（P＜0.05），P21、E-cadherin 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），见图4、表5、表6。

3 讨论

图4 过表达KIFC1 能逆转miR-766-3p 对细胞A549 增殖、迁移、侵袭蛋白表达的作用Figure 4 Overexpression of KIFC1 can reverse the effect of miR-766-3p on proliferation，migration and invasion protein expression of A549 cells

本研究结果显示肺癌组织中miR-766-3p 的表达水平显著低于癌旁正常组织，提示miR-766-3p在肺癌发生及发展过程中可能发挥重要调控作用。研究表明miR-766-3p 在肝细胞癌细胞中呈低表达，并可通过靶向Wnt3a 表达而抑制肝细胞癌进展［8］。研究表明miR-766-3p 低表达可能参与结肠癌发生过程［9］。相关报道指出miR-766-3p 表达量降低可能与非小细胞肺癌紫杉醇耐药性有关［10］。本研究结果显示，miR-766-3p 过表达可显著降低肺癌细胞活力，减少迁移及侵袭细胞数，提示miR-766-3p 过表达可能抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭。为进一步验证miR-766-3p 过表达对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，本研究采用Western blot 法检测增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达，结果显示miR-766-3p 过表达可明显抑制Cyclin D1 的表达，并可促进P21 的表达。同时研究表明E-cadherin 表达水平降低可促进上皮-间质转化（EMT）进而促进肿瘤细胞迁移及侵袭［11］。下调MMP-2 的表达可抑制肺癌细胞迁移及侵袭能力［12］。本研究结果显示，miR-766-3p 过表达可促进E-cadherin 的表达，而抑制MMP-2 的表达，提示miR-766-3p 过表达能够抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭。本研究从体外细胞实验证实miR-766-3p 过表达可减弱肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

表5 过表达KIFC1 能逆转miR-766-3p 对细胞A549 增殖的抑制作用（±s）Table 5 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on A549 cell proliferation（±s）

表5 过表达KIFC1 能逆转miR-766-3p 对细胞A549 增殖的抑制作用（±s）Table 5 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on A549 cell proliferation（±s）

注：与miR-NC 组比较，aP＜0.05；与miR-766-3p+pcDNA3.1 组比较，bP＜0.05。

分组miR-NC miR-766-3p miR-766-3p+pcDNA3.1 miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 F 值P 值n 9 9 9 9 KIFC1 0.82±0.08 0.38±0.04a 0.36±0.04 0.67±0.07b 125.855 0.000 Cyclin D1 0.73±0.07 0.23±0.02a 0.24±0.02 0.58±0.06b 242.194 0.000 P21 0.14±0.01 0.61±0.06a 0.62±0.06 0.20±0.02b 311.494 0.000细胞活性（490 nm）24 h 0.47±0.04 0.26±0.03a 0.28±0.03 0.38±0.04b 67.860 0.000 48 h 0.78±0.08 0.36±0.04a 0.35±0.04 0.65±0.06b 125.546 0.000 72 h 1.05±0.10 0.48±0.05a 0.47±0.05 0.89±0.09b 133.961 0.000

表6 过表达KIFC1 能逆转miR-766-3p 对细胞A549 迁移、侵袭的抑制作用（±s）Table 6 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

表6 过表达KIFC1 能逆转miR-766-3p 对细胞A549 迁移、侵袭的抑制作用（±s）Table 6 Overexpression of KIFC1 can reverse the inhibitory effect of miR-766-3p on migration and invasion of A549 cells（±s）

注：与miR-NC 组比较，aP＜0.05；与miR-766-3p+pcDNA3.1 组比较，bP＜0.05。

分组miR-NC miR-766-3p miR-766-3p+pcDNA3.1 miR-766-3p+pcDNA3.1-KIFC1 F 值P 值n9 9 9 9 E-cadherin 0.21±0.02 0.82±0.08a 0.84±0.08 0.28±0.03b 293.511 0.000 MMP-2 0.84±0.08 0.33±0.03a 0.31±0.03 0.70±0.07b 194.657 0.000迁移细胞数152±15.2 65±6.83a 66±6.81 121±12.3b 139.399 0.000侵袭细胞数139±14.1 59±6.21a 57±6.05 114±11.6b 147.064 0.000

为进一步探究miR-766-3p 调控肺癌细胞生物学行为的分子机制，本研究通过双荧光素酶报告实验证实KIFC1 是miR-766-3p 的靶基因。研究表明KIFC1 可通过调节HMGA1 的表达从而促进肝细胞癌发生发展［13］。研究表明驱动蛋KIFC1 可通过激活Akt /GSK3β 信号传导及促进EMT 转化从而促进膀胱癌细胞增殖及转移［14］。相关报道指出miR-135a 可通过靶向抑制KIFC1的表达从而抑制胃癌发生发展［15］。本研究结果显示，肺癌组织中KIFC1 的表达水平升高，提示KIFC1 在肺癌发生及发展过程中可能发挥癌基因作用。本研究进一步分析显示，抑制KIFC1 的表达可明显降低肺癌细胞活力，并可减少肺癌细胞迁移及侵袭细胞数，提示抑制KIFC1 的表达可减弱肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。同时，本研究将miR-766-3p 过表达与KIFC1 过表达共同处理肺癌细胞，结果显示，肺癌细胞活力明显增强，迁移及侵袭细胞数目明显增多，并可促进Cyclin D1、MMP-2 的表达，而抑制P21、E-cadherin的表达，提示KIFC1 过表达能逆转miR-766-3p 过表达对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。本研究从体外细胞实验证实miR-766-3p 过表达可通过抑制KIFC1 的表达从而降低肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

综上所述，miR-766-3p 可抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭，其主要通过负向调控靶基因KIFC1的表达而发挥作用，可为肺癌的基因治疗提供潜在靶点。