黑天鹅嗜水气单胞菌与肠致病性大肠埃希菌混合感染的诊断

单云芳 钟震宇 李俊芳

(北京麋鹿生态实验中心，北京，100076)

黑天鹅(Cygnusatratus)原产于澳大利亚，体态美丽、优雅，深受喜爱，为世界著名观赏珍禽，近年来作为观赏禽类在国内广泛养殖。黑天鹅抗病力强，成年天鹅不易发病，国内养殖黑天鹅疾病文献极少[1-4]。本研究对北京麋鹿生态实验中心的2只死亡黑天鹅进行分析诊断，确定死亡原因为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和肠致病性大肠埃希菌(Escherichiacoli)混合感染引起的菌血症，现报道如下。

1 发病情况及临床症状

2016年2月5日，北京麋鹿生态实验中心的散养黑天鹅中，2只雄性黑天鹅于其栖息水域中发生激烈争斗，造成其颈部外伤。经望远镜观察其伤口较小，出血量小，随即凝集结痂。5 d后发现2只黑天鹅死于散养区域，经确认为之前发生争斗的2只雄性黑天鹅。在死亡前的几日内，未观察到黑天鹅有明显异常行为，散放区域内其他禽类亦无发病或死亡情况。

2 病理变化

经解剖观察发现，死亡黑天鹅颈部羽毛少量掉落，皮肤有破损结痂，其他部位羽毛完整。颈部及背部见多处瘀伤。心脏外膜出血，有出血斑，心脏冠状脂肪有出血斑，心脏内膜点状出血。肝脏肿大，表面有大面积出血斑和黄色坏死灶。肌胃内见石子、草等食团。胰腺见出血点。十二指肠弥漫性出血。

3 实验室检查结果

3.1 细菌形态观察

无菌采集死亡黑天鹅的肝脏、肾脏涂片，革兰氏染色，在显微镜下可见少量两端钝圆、革兰氏阴性的短杆菌(Gram negative bacilli)，大小约0.8 μm×3 μm；无菌采集心脏血液涂片，革兰氏染色，在显微镜下可见革兰氏阴性的球杆菌(Gram negative coccobacillus)，大小约0.5 μm×2 μm。

3.2 分离培养

分别无菌取肺脏、心脏血液、肝脏、肾脏、脾脏接种于营养琼脂培养基，于需氧及厌氧条件下37℃培养24 h。结果心脏血液培养物长出表面光滑，灰白色圆形菌落，直径1—2 mm，编号为1；肝脏培养物长出圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落，直径2—3 mm，编号为2；厌氧条件下培养基均未长菌。

将1、2号菌落接种麦康凯培养基、SS培养基、血琼脂培养基。结果菌落1血琼脂培养基长出圆形光滑有β溶血环的灰白色菌落，麦康凯培养基长出光滑湿润半透明无色菌落，SS培养基未生长菌落；菌落2血琼脂培养基长出圆形稍凸有β溶血环的灰白色菌落，麦康凯培养基长出不透明红色菌落，SS培养基长出不透明粉红色菌落。

3.3 生化鉴定结果

将1、2号菌落接种生化鉴定管，结果表明，1号菌落为嗜水气单胞菌，2号菌落为大肠埃希菌。

表1 生化试验结果Tab.1 Results of biochemical tests

续表1

3.4 血清学试验

2号菌落肠道致病性大肠埃希菌诊断血清凝集试验阳性，血清型O114∶K90。

3.5 水体检测

无菌采集黑天鹅栖息水域的水样2 L，检测其中总大肠菌群和嗜水气单胞菌。

3.5.1 多管发酵法检测水中总大肠菌群

参考国家环境保护总局出版的《水和废水监测分析方法》中的监测方法检测水体中大肠菌群[5]。将采集的水样做1∶10稀释，于各装有5 mL 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管(内有倒管)中各加10 mL水样，于各装有10 mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管(内有倒管)中各加1 mL水样，于各装有10 mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管(内有倒管)中各加1 mL 1∶10稀释的水样，共计15管，3个稀释度，于37℃培养24 h。将产酸产气的培养物接种于美蓝培养基上，37℃培养24 h，结果长出深紫黑色具有金属光泽和紫黑色不带金属光泽的菌落。将菌落接种于乳糖蛋白胨培养液中进行复发酵试验，结果均产酸产气，证实有大肠菌群存在。

3.5.2 致病性嗜水气单胞菌检测

参考国家标准《致病性嗜水气单胞菌检验方法》(标准号：GB/T 18652—2002)检测水样中的嗜水气单胞菌[6]。将水样用孔径为0.2 μm的硝酸纤维素微孔滤膜过滤。滤膜置于灭菌碱性蛋白胨水中，于28℃培养24 h。培养物接种于普通琼脂培养基，于28℃培养24 h，结果长出光滑、微凸、圆整、淡黄色菌落，直径1—2 mm。挑取菌落革兰氏染色镜检，显微镜下可见革兰氏阴性球杆菌，大小约0.5 μm×2 μm。将菌落接种于AHM鉴别培养基，结果培养基顶部为紫色，底部为淡黄色。同时进行氧化酶试验、吲哚试验、糖发酵试验(葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、水杨苷)和脱脂奶培养基试验，结果如下。

表2 大肠菌群检测结果Tab.2 Monitoring result of coliform bacteria

表3 嗜水气单胞菌鉴定结果Tab.3 Identification result of Aeromonas hydrophila

3.5.3 结果

水样中存在嗜水气单胞菌和大肠埃希菌，推断为感染源。

4 分析与体会

4.1 防治措施

对黑天鹅栖息水域消毒，水体(以1 m水深计)可泼洒10%—20%生石灰溶液40—50 g/m2(也可使用漂白粉1.0—1.5 g/m2、氯异氰尿酸钠消毒剂0.2—0.5 g/m2、二氧化氯消毒剂0.1—0.3 g/m2、适量双链季铵盐络合碘消毒剂)，15—30 d/次，若能够清塘后消毒，消毒剂用量可将酌情减少[7]。购买禽用嗜水气单胞菌灭活疫苗进行定期免疫接种。为预防和控制感染，可选用庆大霉素、头孢拉定、丁胺卡那霉素等敏感抗生素[8]，同时可给予维生素B、维生素C等辅助药物。

肠道致病性大肠埃希菌O114∶K90可引起人食物中毒腹泻[9-11]，需要对天鹅尸体、培养物、污染物统一无害化处理，对尸体污染和解剖台等场地进行严格消毒，防止病原菌扩散。操作人员按照要求严格防护。

饲养管理水平是影响疫病发生的首要因素，需定期进行水质检测，清塘换水和消毒，消灭感染源；患病或受伤的畜禽要及时治疗，清创喂药，隔离观察，防止病情加重或死亡；提高饲养水平，重视畜禽的健康状况，避免感染或体质降低而诱发其他疫病。

4.2 大肠埃希菌和嗜水气单胞菌混合感染诊断的分析

大肠埃希菌寄居在动物的肠道，是肠道正常菌群，也是临床常见病原菌，在特定条件下可引起动物体各部位感染，发生病变。解剖结果表明，动物体肝脏肿大，出血严重，表面有黄色坏死灶，与张恩强[12]、刘明生等[13]的报道一致，呈现长期慢性病理过程，因此推测动物体在伤口感染之前已发生大肠杆菌病，导致动物体持续精神沉郁，免疫力下降，在打斗中易受伤害。嗜水气单胞菌属弧菌科(Vibrionaceae)气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽孢和荚膜，是一种条件致病菌，在自然界尤其水中广泛分布。本研究从患病黑天鹅体内分离出一株嗜水气单胞菌，该菌在琼脂平板上形成圆形凸起、表面光滑、灰白色的菌落，与杜毅超等[14]的报道一致。另外，嗜水气单胞菌是水产养殖中常见致病菌，可感染水生动物、水禽和人，引起动物肠内和肠外感染；主要表现为腹泻和菌血症。由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛，多为恶性传染病，病程短，死亡率高[15]。本研究中黑天鹅由于慢性感染，抗病力下降，皮肤伤口接触被本菌污染的水而受染，产生急性病理过程。

麋鹿中心定期对动物活动区域进行清洁、消毒，但由于冬天水面结冰，为消毒工作带来困难，仅留的活水面积减小，水禽活动范围减小，集中排便污染水体易导致水体菌群结构发生变化，为各种病原菌的传播创造条件。

综合临床症状、病理解剖和实验室检查结果可判断，黑天鹅直接死亡原因为打斗后受伤，经伤口感染嗜水气单胞菌，导致菌血症死亡。