大熊猫与亚洲黑熊的红细胞膜蛋白质谱检测

邓林华 赵俸涌 李 勤 黄 山魏 明 张亚辉 王承东 李德生* 朱自严*

(1.中国大熊猫保护研究中心，大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，都江堰，611830；2.上海市血液中心，上海，200051)

血液作为机体气体及物质转运的重要结缔组织，其生理生化的改变与生命体活动息息相关，红细胞作为气体运输的唯一载体，直接决定着生命体的气体代谢。熊科(Ursidae)动物分布较广，部分种具有冬眠的生活特性，导致红细胞(red blood cell，RBC)生理生化亦发生改变以适应生命体活动，如冬眠中的棕熊(Ursusarctos)，红细胞抗氧化物质积累以抵抗其低代谢情况下有害物质的积聚，从而保护红细胞的生存[1]。

成熟的哺乳动物红细胞无核，其仅可通过无氧酵解途径供能，而糖酵解依赖的丰富酶系一般通过与骨架蛋白互作而定位于红细胞膜内侧[2-3]，其气体代谢功能行使所依赖的多种通道蛋白一般以多次穿膜的跨膜蛋白形式存在[4-5]，故红细胞气体代谢功能主要是以膜蛋白为基础，这一点在其他哺乳动物红细胞膜研究中已被充分证实，同时在一些生活习性特化的哺乳动物中，膜蛋白数量也发生变化以适应生命活动需要，如骆驼科(Camelidae)动物红细胞为椭球型，带3蛋白大量表达以适应其血液渗透压的变化[6]。

红细胞膜蛋白研究早期以蛋白电泳为主，随着蛋白质组学的技术发展，目前较为全面地对红细胞膜蛋白开展的研究一般采用质谱技术。质谱技术按照对待测样品添加电荷的不同而分为若干技术，但这些技术的共通之处是对蛋白质酶解后的多肽片段进行电荷标记，通过质量/电荷的数值(质荷比M/Z)对该多肽片段进行分离，分离后的带电多肽片段通过电场磁场的筛选，最后通过检测器检测。由于蛋白质被酶解后形成的肽指纹图谱是唯一的，故当检出多肽片段通过打分超过阈值后，就可以认定该蛋白的存在。正由于以上原因导致质谱技术可同时处理较大量样本信息，故对于未知蛋白样品的分析十分有用[7-9]。本研究基于探索大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)红细胞膜蛋白组学，通过液相色谱串联二级质谱(LC-MS/MS)技术，对大熊猫及亚洲黑熊(Ursusthibetanus)红细胞进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血液样本来源及抗凝方法

本实验使用的大熊猫及亚洲黑熊血液来自于中国大熊猫保护研究中心，血液样本为4—10月采集(本实验中涉及大熊猫样本为成年健康雄性，采样年龄10岁；亚洲黑熊为成年健康雄性，年龄8岁)，血液采用EDTA·2K抗凝，采集血样4℃运输，12 h内进行实验。人类及C57BL6小鼠红细胞样本为检验合格后的实验废样。

1.1.2 主要试剂及仪器

主要试剂：1 moL/LTris-HCl母液(上海生工生物B548142)，20×PBS母液(上海生工生物B548117)，Hoechst33342染料(B-2261，Sigma)。

主要仪器：离心机(Beckman-optima)，蛋白电泳仪(BIO-RAD)，分选流式细胞仪(Aria sorp，BD)质谱仪TripleTOF5600系统结合纳升喷雾Ⅲ离子源(AB SCIEX)。

1.2 方法

1.2.1 血液分离

大熊猫抗凝血样经自然沉降后，使用移液器移去白膜层后，吸弃血浆，将剩余压积红细胞1∶50稀释于1×PBS中。

1.2.2 红细胞分选

将Hoechst33342染料配置成5 000 μg/mL母液，按照1 μL/1 mL比例加入上步制备红悬液中，冰浴孵育30 min。流式分选仪提前30 min预热，通过SSC与FSC参数，设门去除细胞碎片，血小板及黏连细胞；然后通过Hoechst33342染料荧光设门，去除有核细胞；最后将单个完整红细胞分选至无菌15 mL离心管中。取500 μL分选后细胞悬液，离心后，去除400 μL上清，轻柔重悬细胞后，制片，置于显微镜下观察。

1.2.3 细胞膜蛋白制备

将分选后的红细胞3 500 rpm，离心5 min，小心移除上清，加入40倍体积的低渗液(0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)，充分混匀，冰浴30 min，4℃，40 000 rpm，离心20 min，沉淀用低渗溶液洗3次。将大熊猫红细胞血影中加入200 μL RIPA裂解液，震荡混匀，冰上放置30 min，5 000 rpm，离心5 min，上清即为可溶性膜蛋白溶液。

1.2.4 膜蛋白质谱检测

将蛋白样品测定浓度后，进行SDS-PAGE电泳，并将凝胶进行切胶回收、蛋白质再溶解、蛋白质样本纯化、脱盐及加基质后，进行LC-MS/MS检测。色谱分离采用2 μL/min的流速上样。质谱喷雾电压为2.5 kV，气帘气压为30 PSI，雾化气压为5 PSI，加热器温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式。

1.2.5 数据处理

采用Mascot 2.3软件(Matrix Science)对质谱结果原始数据进行处理，消化酶选择胰蛋白酶，允许最大漏切位点为2；固定修饰为：Carbamidomethyl(C)；可变修饰为：Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)、Oxidation(M)、Phospho(ST)和Phospho(Y)；MS容差为±15 ppm，MSMS容差为±0.15 Da，Protein score C.I.%大于95%为鉴定成功。

2 实验结果

2.1 大熊猫、亚洲黑熊流式分选纯化

大熊猫红细胞悬液样本染色后，根据血细胞特性，使用SSC和FSC参数差异去除掉细胞碎片，血小板及黏连细胞，使用Hoechst染料去除掉有核细胞，获得高纯度大熊猫红细胞，并对分选后细胞悬液浓缩后制片观察进行验证，结果如下(图1)。

2.2 大熊猫、亚洲黑熊红细胞膜蛋白电泳检测

大熊猫与亚洲黑熊红细胞膜蛋白SDS-PAGE分析，从结果中发现，条带上大熊猫、亚洲黑熊与人类分布差不多，小鼠明显少于三者。

2.3 大熊猫、亚洲黑熊红细胞膜蛋白质谱检测

通过Blast2GO软件对大熊猫及亚洲黑熊红细胞膜蛋白进行质谱原始结果注释，共注释大熊猫可溶性红细胞膜蛋白388种，在亚洲黑熊中共注释出315种红细胞膜蛋白。大熊猫与亚洲黑熊红细胞膜蛋白在细胞上的定位主要在于膜部分、胞外区、胞内区及蛋白复合体，大熊猫红细胞膜蛋白和亚洲黑熊膜蛋白在细胞上的定位位置基本相同。大熊猫和亚洲黑熊膜蛋白发挥催化功能的蛋白从种类上分析差不多，主要有水解酶、转移酶、氧化还原酶和裂解酶；数量上，大熊猫红细胞所含各类酶组分较亚洲黑熊丰富。结果见表1，对这些酶类进行检索后发现，大熊猫较亚洲黑熊在糖酵解及物质转运相关蛋白及酶系有诸多特有蛋白或酶类亚类，结果见表2。

表1 大熊猫、亚洲黑熊膜蛋白质谱检测结果Tab.1 Mass spectrometry results of RBC membrane proteins from giant panda and Asian black bear

2.4 大熊猫、亚洲黑熊红细胞膜蛋白功能分类分析

在用生物功能对大熊猫及亚洲黑熊膜蛋白进行区分后，对比可知，大熊猫与亚洲黑熊膜蛋白上都发挥了比较相似的作用，如结合、酶催化、生物识别、信号转导和转运，结果发现二者蛋白分类相似，大熊猫比亚洲黑熊红细胞膜上存在约20种与代谢相关蛋白类。

3 讨论

质谱技术在人类红细胞膜蛋白的研究中已有很广泛的应用。2006年，Pasini等[10]对红细胞膜蛋白通过LTQ-FT质谱技术鉴定出252种可溶性膜蛋白，并对这些蛋白在细胞膜上存在的位置、生物学功能进行了分类讨论。在随后的研究中，研究人员通过对储存3 d、21 d、42 d后的红细胞膜蛋白通过LC-MS/MS进行蛋白质组研究，发现红细胞膜表面发挥酶功能的蛋白及信号转到相关的蛋白含量下降，认为这可能是储存后的红细胞生存能力减弱的原因[11]。一些研究人员通过质谱技术从蛋白质组学上分析了人与小鼠的差别[12]，在红细胞膜蛋白功能方面的研究中通过敲除小鼠对半胱氨酸的氧化过程进行了分析[13]，还通过红细胞胞浆蛋白的质谱分析，发现了先天再生障碍性贫血患者独特的炎性反应[14]。

由于大熊猫红细胞膜蛋白承载着红细胞所行使的生理功能，而目前尚无针对细胞膜蛋白的研究。在对大熊猫红细胞膜蛋白的研究中，通过SDS-PAGE条带分析可以发现，大熊猫与亚洲黑熊蛋白条带数目相近，说明所含蛋白种类相似度较高(图2)，这也提示大熊猫红细胞膜表面蛋白和亚洲黑熊红细胞膜表面蛋白种类可能相差不大。在进一步通过质谱研究中，我们发现大熊猫与亚洲黑熊的红细胞具有功能类似的膜蛋白组成，在这些生物功能中的代谢部分大熊猫较亚洲黑熊多20种(表2，图3)，这提示可能大熊猫随着生活习性特化，导致其体内生命活动过程发生了改变，最终导致其红细胞膜蛋白功能的改变以适应上述变化。本研究中未发现亚洲黑熊较大熊猫具有特有的膜蛋白，其可能的原因是，目前亚洲黑熊尚无参比序列及相关蛋白数据库，故质谱结果仅可根据大熊猫数据库进行比对，可能导致少部分蛋白注释存在偏差。

表2 大熊猫、亚洲黑熊红细胞膜蛋白差异蛋白涉及生物学过程Tab.2 Distinct membrane proteins involved in different pathway in giant panda

续表2

在质谱检测中我们还发现蛋白注释结果中有很多属于内膜系统的蛋白质。由于成熟的哺乳动物红细胞只有细胞膜而不含有其他的亚细胞结构膜系统。所以理论上讲，由红细胞制备的细胞膜蛋白不会有内膜系统的干扰，故在大熊猫红细胞膜上所鉴定到的其他内膜系统上的蛋白来源只有一种可能，就是当红细胞脱核后，这些蛋白重新定位到红细胞膜上，继而可能发挥新的生理功能。这一过程发生的机理、膜蛋白定位的变化及与其定位到红细胞膜后的特定生理功能还有待进一步研究。

4 结论

通过膜蛋白电泳及质谱检测对大熊猫及亚洲黑熊红细胞膜蛋白进行研究后，发现大熊猫与亚洲黑熊红细胞膜蛋白组成符合哺乳动物红细胞膜组成规律。通过膜蛋白质谱检测共检测标定大熊猫红细胞膜蛋白388种，亚洲黑熊红细胞膜蛋白315种。