黄羊源性成分检测方法的研究

2021-01-13 03:47王伊琴陈少博包勇敢荆文魁康晓平
野生动物学报 2021年1期
关键词:黄羊源性质粒

王伊琴 陈少博 杨 帆 包勇敢 荆文魁 常 鸿 康晓平

(1.二连海关技术中心,二连浩特,011100;2.呼和浩特海关,呼和浩特,010010;3.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所,北京,010071)

野生动物是大自然的产物,世界各国对珍贵、濒危的野生动物实行重点保护。黄羊(Procapragutturosa)是我国Ⅱ级保护野生动物,中国濒危动物红皮书濒危物种,主要分布于蒙古国的东部草原,中国的呼伦贝尔盟、锡林郭勒盟、乌兰察布盟,并集中分布在两国的边境地带。栖息于半干旱的草原,草食性,性喜群栖,集群的时间比较长,移动的距离和范围也大,一般在春季和秋季进行大规模迁移,同时黄羊也受国际公约保护迁徙野生动物保护公约的保护[1]。20世纪70年代,内蒙古草原有野生黄羊300多万头,八九十年代,内蒙古还有野生黄羊100万头左右。最近20年来,由于盗猎分子的疯狂猎杀,目前估计整个内蒙古只有几千只[2-3]。每年冬季蒙古国大量黄羊越境到中国过冬,过冬之后又返回蒙古国,据统计仅2015年12月9日,有近600只黄羊通过二连浩特进入中国境内,为保护好这批野生黄羊,有关部门日夜坚守,密切关注野生黄羊群动向,确保野生黄羊在中国境内的安全。但是,在蒙古国和中国部分地区存在以猎捕野生黄羊为乐、以猎捕野生黄羊贩卖谋取利益,使野生黄羊资源遭到严重的破坏[4-5]。又因为蒙古国是口蹄疫、小反刍兽疫的疫区,由于黄羊肉可食用,黄羊角可入药,通过黄羊携带疫病、疫情传入我国的风险日益增加,时刻威胁我国公共卫生安全。这就要求我们加强保护野生动物标准体系的建设,在进出口动物及其制品中准确甄别动物源性,确保世界迁徙野生动物受到保护,维护公共生物安全体系,从源头上打击走私贩卖行为,黄羊源性成分的快速、灵敏、准确的检测技术研究,为保护我国濒危野生动物资源,为海关缉私执法提供了强有力的技术保障。

目前,黄羊源性成分的检测技术的研究尚未见有相关的报道,本研究通过对黄羊的组织分别进行PCR和Real-time PCR检测,分别进行了特异性、灵敏性和稳定性试验,结果表明2种技术均能满足日常的动物源性成分的检测要求,为保证准确甄别源性成分提供了强有力的技术保证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

基因组DNA提取试剂盒购于Bio Dev-Tech公司,DNA凝胶回收试剂盒及pGEM-T Easy载体购于Promega公司;Taqplus DNA聚合酶、限制性内切酶EcoR I 及DNA Marker 为TaKaRa 公司产品;大肠杆菌感受态细胞购于Trans Gene Biotech公司,其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 样品

本试验是在无菌条件下采取了6份健康黄羊的皮毛、肉等组织样品。

1.2 方法

1.2.1 引物

根据GenBank中已发表序列(DQ266332.1),应用Primer Premier 5.0设计特异性引物,针对黄羊线粒体基因设计引物序列如下:

由上海生工合成。

上游引物:5′-CTAGGCAACATGCATATC-3′;

下游引物:5′-CGAGAAGAGAAATCCTTG-3′。

探针:5′-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TA MRA-3′。

1.2.2 阳性质粒的制备和酶切鉴定

利用本试验所设计的引物,黄羊DNA进行PCR扩增,将PCR产物利用胶回收试剂盒进行回收和纯化,纯化后PCR扩增产物与pGEM-T easy vector进行连接,4℃水浴过夜。将上述连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布于含有氨苄青霉素,X-gal和IPTG的LB琼脂平板,于37℃温箱中倒置培养20 h,随机挑取白色菌落进行筛选。挑取单个菌落接种于含氨苄青霉素的LB 培养液中,37℃振荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒制备质粒,然后对其进行酶切和PCR鉴定,同时并送至上海生工公司进行测序分析。

1.2.3 普通PCR的扩增

该引物扩增了94 bp核苷酸。基因组总DNA的提取按试剂盒方法进行。PCR反应在25 μL体系中进行,其中含有:基因组DNA 200 ng,引物0.5 μM,dNTP 200 μM,Taqplus DNA Polymerase(5 U/μL)0.5 μL,0.1M10×Ammonium Buffer,ddH2O 17 μL,进行PCR扩增,循环条件如下。

94℃预变性5 min,94℃变性30 s,61℃退火40 s,72℃延伸40 s,共循环36次,最后于72℃延伸8 min。

1.2.4 Real-time PCR反应

PCR扩增体系25 μL:Premix ExTaqTM12.5 μL,上下游引物、探针(10 μmol/L)各1 μL,DNA 模板2 μL,ddH2O 7.5 μL。

扩增条件:94℃预变性10 min,94℃变性15 s,58℃退火,延伸1 min,40个循环,58℃收集荧光。

1.3 PCR和Real-time PCR的特异性试验

以同种方法提取等量的黄羊、牛(Bos)、羊(Caprinae)、马(Equuscaballus)、猪(Sus)、鼠(Rattus)、鸡(chicken)DNA和水(空白对照)为模版,分别进行PCR和Real-time PCR检测,检测其特异性。

1.4 PCR和Real-time PCR的灵敏性试验

黄羊阳性质粒浓度(97.3 μg/mL)为模板,对该阳性质粒进行 10 倍系列稀释,取6个梯度的DNA浓度,分别进行PCR及Real-time PCR扩增,检测反应的灵敏性,并以其对应的拷贝数的对数与Ct值做标准曲线,评价其灵敏性。

1.5 Real-time PCR稳定性试验

黄羊阳性质粒浓度(97.3 μg/mL)为模板,做10倍系列稀释,取10-1—10-5倍比稀释的5个梯度的DNA模板进行重复性试验,每次试验设3次重复,共进行3次试验,计算组内和组间Ct值的变异系数。

2 结果

2.1 样品的DNA浓度及纯度

所提取样品的DNA 浓度在20.8—244 ng/μL范围内,A260/280在1.8—2.0间,完全可满足PCR和Real-time PCR 检测的要求。

2.2 普通PCR扩增、克隆和酶切鉴定

PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,条带大小与扩增片段基本一致约为94 bp(图1),初步证实为黄羊的目的基因。PCR 产物纯化后克隆到载体中,转化后挑取阳性菌落,经EcoR I 酶切可获得3 000 bp和94 bp左右2个条带,(pGEM-T Easy 载体两端分别存在1个EcoRⅠ酶切位点),这与载体和插入目的的片段大小正好相符(图略)。同时应用上、下游引物在重组质粒中PCR 扩增出大小约为94 bp 的条带,结果表明扩增片段已经插入载体中(图1)。

2.3 普通PCR的特异性试验

分别对黄羊、马、牛、羊、猪、鼠、鸡的DNA以及水(空白对照)进行扩增,以检测方法的特异性。

2.4 普通PCR的灵敏性试验

黄羊质粒DNA的浓度为97.3 ng/μL 。用ddH2O依次10倍稀释7个梯度,即每个反应模板浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL,以确定方法对单一模板的灵敏度,该方法的灵敏度为0.1 ng/μL。

2.5 Real-time PCR的特异性试验

用黄羊引物探针体系分别对黄羊、马、牛、羊、猪、鼠、鸡、水的DNA 进行扩增,由图4可见,黄羊的DNA在Ct值为12.39时出现扩增曲线,其他动物组织和空白对照则没有扩增曲线。

2.6 Real-time PCR的灵敏性试验

图5中曲线从左向右加入模板DNA浓度依次是100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.000 1 ng/μL,对应的Ct值分别为13.24、17.77、20.07、24.56、28.06、31.65、36.12。Ct值<35的最大稀释度溶液中的模板DNA含量为0.001 ng/μL,即为黄羊源性成分检测的灵敏度。

以x轴代表质粒拷贝数的对数,y轴代表Ct值,绘制标准曲线图6。

根据图6标准曲线可知,当质粒浓度从100 ng/μL—10-4ng/μL 时,随质粒稀释度的增加,对应的Ct值也逐渐增大,且具有一定的线性关系。y=-3.7282 log 拷贝数+39.409,相关系数R2=0.996 6,说明在模板浓度范围内都具有很好的线性关系,可以用于样品的定量分析。

2.7 Real-time PCR的组内、组间稳定性试验

2.7.1 组内稳定性试验

如表1所示,模板DNA浓度10—0.001 ng/μL的5个倍比稀释度内,每一稀释度内做3个重复,Real-time PCR扩增反应的Ct值的标准差从0.06—0.60,变异系数0.314%—1.797%,图7的扩增结果曲线也表明所建立的方法具有较好的组内稳定性。

表1 不同DNA浓度下组内、组间重复性试验结果Tab.1 The results of intra and inter group repeatability tests at different DNA concentrations

2.7.2 组间稳定性试验

如表1所示,模板DNA浓度10—0.001 ng/μL的5个倍比稀释度内,每个稀释度做一次试验,共做3次试验,Real-time PCR扩增反应的Ct值的标准差从0.15—3.32,变异系数0.671%—7.144%,图8的扩增结果曲线也表明所建立的方法具有一定的组间稳定性。

3 讨论

2013年欧洲爆发的马肉风波,美国“沃尔玛狐狸肉造假”事件,揭露了肉制品的掺假现象的严重性,引发了全球公众对肉制品安全的担忧[6]。我国食品风险监测已将肉制品的动物源性成分鉴定(牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测)纳入到常规监测中[7]。濒危野生动物物种DNA鉴定技术是打击肉制品掺假、走私,维护市场秩序,保护野生动物资源,提供了强有力的技术保障。

3.1 基于DNA 特异性序列分析方法建立的核心内容是选择物种特异性DNA 靶序列。由于动物细胞存在2套基因组DNA,分别是线粒体基因组DNA 和核基因组DNA,因此,特异性DNA 靶序列选择时存在2种可能,一种源于线粒体基因组DNA,另外一种源于核基因组DNA。目前,报道和应用的动物源性成分检测方法大部分是针对线粒体基因组DNA 靶序列的,如12S RNA,16S RNA,18S RNA,Cybt序列等。此外越来越多的研究开始筛选核基因组DNA 特异性靶序列,如MC1R、LF、TRF、IL-2、β-actin、cGMP、BGH、cGMP、PDEs、RyR、MY等,并将其用于动物源性成分检测[8]。

3.2 黄羊属于洞角科(Bovidae),其物种进化的同源性表明与牛的同源性大于98%,高于羊的同源性95%[9],本研究PCR和Real-time PCR方法,对检测的特异性分析结果,与牛、羊等未见有交叉扩增,均有很好的特异性。

3.3 本研究中的灵敏性特点分析,普通PCR法灵敏度分析,模板DNA灵敏度为0.1 ng/μL,较之孙艳华等[10]建立的普通 PCR 检测熟肉肉类来源的方法检测限为5%,本研究更具灵敏性,同时,普通 PCR 存在耗时长、产物易污染等不足[11]。

Real-time PCR方法灵敏度分析,模板DNA灵敏度0.001 ng/μL,较之Jonker 等[12]建立的检测体系 50 pg/μL 更为灵敏,灵敏度线性相关系数R2=0.996 6,可以定量研究Ct值与拷贝数的关系。较之Wang等[13]建立的应用牦牛肉的方法体系0.001%相一致,与Fang等和Druml等[14-15]建立的方法体系,检出限1 pg相同。总之,本研究所设计的黄羊引物、探针体系以线粒体细胞色素b基因为目的基因,Real-time PCR方法特异性、灵敏性、稳定性均优于普通PCR方法,而且可以量化分析,是探索动物源性成分检测方法的优势方法,其缺点是仪器设备要求高、价格高,对于基层检测单位不利于满足设备要求[16]。

3.4 组内、组间稳定性试验研究分析,组内稳定性试验研究中,模板DNA 0.001 ng/μL时,平均Ct值33.23,变异系数CV%为0.018,较模板浓度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.004 3高了近1个数量级。组间稳定性试验研究中,模板DNA 0.001 ng/μL时,Ct值32.49,变异系数CV%为0.071,较模板浓度10—0.01 ng/μL的平均CV%0.018高5倍。因此,根据稳定性的研究,组内CV%、组间CV%均小于25%,符合联合国粮农组织(FAO)统一的检测数据评价标准。并组内试验的稳定性好于组间试验。模板DNA稀释度越高,Ct接近阈值35时,组内、组间稳定性试验Ct值的SD越高,CV%大,试验的稳定性也越差。

3.5 研究成果标准化后,应用推广将对保障我国国境口岸野生动物物种鉴定发挥重要的作用,为保护濒危野生动物资源,为海关缉私执法提供了强有力的技术保障。

猜你喜欢
黄羊源性质粒
中南大学发现治疗雄性激素源性脱发新方法
功能训练联合任脉灸用于骶上脊髓损伤后神经源性膀胱的护理效果观察
农杆菌转化法中的“Ti质粒转化载体系统”的简介
——一道江苏高考题的奥秘解读和拓展
全基因组测序后质粒的组装与鉴定研究进展*
便携式膀胱扫描仪结合间歇性导尿术在脑卒中合并神经源性膀胱患者中的应用
mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33∶A-∶B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析
开发新方法追踪植物病害的全球传播(2020.6.7 iPlants)
母黄羊之死
射频消融联合椎间盘内亚甲蓝注射治疗25例椎间盘源性腰痛的临床分析
沙漠向导