饲用抗菌肽的生物学功能及在断奶仔猪和肉鸡上的应用研究进展

■刘作华 苏国旗黄金秀 杨飞云

（重庆市畜牧科学院，重庆 406420）

抗生素耐药性（AMR）是指微生物对原本敏感的抗生素产生高度耐受的特性，通常通过基因改变自然发生，人、动物、植物和环境中都存在抗生素耐药生物[1]。畜禽养殖生产中过度使用抗生素会加剧AMR产生，为了控制AMR恶化与蔓延，欧美各国先后出台相关政策禁止在饲料中使用抗生素，我国也从2020年7月1日起全面实施饲料禁抗。虽然饲料禁抗能直接减少饲用抗生素的用量，但随之会带来畜禽生长速度变慢，发病率和死亡率增加，同时导致治疗用抗生素的用量增加。因此，寻找新型安全、高效的促生长饲料添加剂，是当前世界各国研究的热点。抗菌肽（AMP）是生物体固有免疫的重要组成部分，广泛存在于自然界各种生物体中，具有抗细菌、真菌、病毒和寄生虫等活性，主要机制是破坏病原微生物的细胞膜，因此不易产生AMR，已经成为农学、微生物学、生物医学等领域的研究热点之一，应用前景十分广泛。大量研究表明，畜禽饲粮中添加AMP具有促进生长、增加肠道健康和提高免疫力等功能[2-4]。文章综述了AMP的特性、生物学功能及在断奶仔猪和肉鸡上的应用效果，为饲用抗菌肽的合理研发与科学应用提供参考。

1 抗菌肽的特性

自20世纪80年代发现天蚕素（cecropins A和B）以来，目前已有数千种AMP被发现和鉴定，广泛存在于古生菌、原生生物、细菌、病毒、植物和动物等生物体中，是机体免疫系统的第一道防线[5]。AMP虽种类繁多，但存在一些共同特点。AMP通常是由核糖体合成的无活性前肽，再加工成10～50个氨基酸残基组成的具有活性的成熟肽。成熟的AMP通常含有大量的阳离子残基，在中性条件下带正电荷。此外，AMP还具有高比例的疏水氨基酸，有助于AMP折叠成为具有两亲性的二级结构，疏水残基位于AMP分子一侧，阳离子和极性残基位于分子的另一侧。AMP具有α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲、环化等多种结构形式[6]。一些分子量较大的AMP主要通过分子内二硫键或肽主链的环化来形成稳定结构。不同AMP的活性不尽相同，主要是通过抑制细胞膜形成或破坏细胞膜的完整性来抑杀病原微生物，所以AMP不易产生耐药性。

2 抗菌肽的生物学功能

2.1 抗细菌

抗菌活性是AMP最基本的功能之一。许多AMP对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑杀活性，如蜂毒素[7]、蛙皮素[8]、天蚕素[9]和抗菌肽 LL-37[10]。AMP 能够抑杀细菌，是因为它们带有阳离子，对革兰氏阳性细菌的磷壁酸、脂壁酸及革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS）具有静电吸引，使微生物外膜不稳定，引起细胞膜迁移，破坏细胞膜的完整性，最终导致细菌裂解死亡。大多数AMP可与细菌细胞膜相互作用，其作用机制主要有9种模式：①电穿孔；②地毯模型；③膜变薄或增厚；④非溶解膜去极化；⑤环形孔；⑥氧化脂质靶向；⑦桶形壁；⑧无序环形孔；⑨非双层中间体[11]。除膜渗透作用外，AMP还可以通过靶向细胞内容物来抑制转录、翻译或其他过程，也可以通过抑制肽聚糖、脂多糖或其他生物合成途径中的前体或中间体的生成，以干扰细胞壁的合成及细菌增殖，从而起到抑杀细菌的作用[12]。

2.2 抗真菌

人们迄今已发现399种真菌威胁人类健康，有些药物虽对真菌有抑杀功能，但仅对少数特定的分子靶点起作用，且容易产生AMR[13]。近年的研究表明，一些AMP具有抗真菌活性，多肽PAF26及其衍生物主要通过能量依赖的内吞作用发挥抗真菌活性[14]。Astacidin 1是一种从小龙虾血色素中分离得到的AMP，对白色念珠菌、毛孢子菌、秕糠马拉癣菌和红色毛癣菌具有较强的抑杀活性[15]。另外，14-螺旋疏水β多肽也能阻止白色念珠菌、光滑念珠菌、附毛念珠菌和热带念珠菌生物膜的形成[16]。膜渗透是大多数抗真菌多肽的主要作用机制，AMP可直接与真菌细胞膜上的受体结合，干扰细胞壁合成；也可进入细胞质，引起线粒体耗损，最终杀死真菌[16]。此外，一些抗真菌多肽还可与白念珠菌基因组DNA相互作用，诱导细胞周期在S期停滞[17]，也可以通过活性氧（ROS）的产生诱导酵母细胞凋亡[18]。

2.3 抗病毒

许多AMP都具有抑制多种病毒感染的能力，包括由包膜RNA和DNA病毒、猫杯状病毒和埃可病毒引起的感染[19]。α-螺旋多肽如蜂毒素、蛙皮素和皮抑菌肽，具有高效的抗单纯疱疹病毒活性[20]。其中，蜂毒素能抑制病毒的种类很多，包括柯萨奇病毒、肠道病毒、甲型流感病毒、人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、胡宁（Junín）病毒、呼吸道合胞病毒、水疱性口炎病毒和烟草花叶病毒等[21]。此外，一些β-折叠多肽如防御素、鲎素、蛋白整合素（protegrins）和β转角多肽乳铁蛋白，也表现出对单纯疱疹病毒的高活性[12,22]。防御素是一种天然免疫系统的效应成分，具有广泛的抗病毒活性，其抗病毒机制除抑制病毒融合和进入后中和外，还能直接作用于病毒包膜、糖蛋白和核衣壳，结合宿主细胞表面受体和调节细胞内信号传导等间接抑制病毒复制。此外，防御素还可作为趋化因子改变适应性免疫反应，间接抗病毒[23]。

2.4 抗寄生虫

寄生性原生虫病每年在全世界造成数百万人死亡，特别在热带地区超过30亿人受到疟疾感染的威胁。蜂毒素、天蚕素、马痘苗素、牛骨髓抗菌肽18、牛抗菌肽BMAP-27和蛋白整合素（PG 1）等都具有良好的抗寄生虫活性[24]，AMP抗寄生虫活性与寄生虫的发育阶段无关[25]。ParaPep是一个收录抗寄生虫多肽的数据库，收录的大多数AMP对不同种类的疟原虫、利什曼原虫和锥虫都具有抑制生长的活性[26]。AMP具有多种抗寄生虫的机制，但主要是破坏细胞膜[25]。

2.5 免疫调节

许多AMP在体外适宜条件下具有良好的抗菌活性，而在动物体内，受生理浓度的单价和二价阳离子、阴离子、血清或大分子物质的影响，其抗菌活性往往被抑制[27]。然而，AMP可以选择性地调节宿主免疫功能，促进机体抗微生物感染的能力[27]。研究表明AMP免疫调节功能主要表现为：①抗内毒素活性；②作为疫苗佐剂；③促进肥大细胞脱颗粒；④促进伤口修复；⑤诱导免疫细胞分化；⑥抑制促炎因子如TNF-α；⑦激活和招募巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞；⑧促进血管生成；⑨中和巨噬细胞和单核细胞释放的促炎细胞因子[27]。AMP通过结合蛋白分子发挥免疫活性。胞壁二肽MDP和GMDP是从入侵细菌的细胞壁释放出的有效的佐剂和免疫刺激器，可以通过特异性结合YB1（Y-box protein 1）发挥免疫活性，而YB1是胞浆蛋白在细胞核、细胞质、细胞膜和胞外环境之间循环的一类特殊蛋白质[28]。此外，乳铁蛋白20（LFP 20）可以通过MyD88/NF-κB和MyD88/MAPK信号通路来降低LPS诱导的促炎因子释放[29]。

3 抗菌肽在断奶仔猪和肉鸡上的应用

抗生素在畜牧产业中的应用已有50多年的历史，促进了畜禽养殖的生产效率提升，但长期或超量使用也造成耐药菌株和动物性食品残留等问题[30]。欧美国家和我国先后禁止在畜禽饲料中使用促生长类药物饲料添加剂。为了应对饲料禁抗带来的负面影响，迫切需要探求新的促生长策略。AMP具有在畜禽养殖中应用的巨大潜力，因为它们可以提高生产性能、促进肠道健康和增强免疫功能。下面将着重阐述AMP在断奶仔猪和肉鸡上的应用效果。

3.1 断奶仔猪

仔猪断奶是生猪养殖过程中的关键环节，断奶应激通常会导致饲料利用率下降、生长受阻、腹泻率增加，甚至出现死亡。AMP因具有抗微生物活性和免疫调节功能而被广泛研究用于断奶仔猪饲粮中，以期达到促进生长和提高免疫的效果。研究表明，大肠杆菌素、小菌素J25（Microcin J25）、天蚕素A（cecropin AD）、防御素和人工合成AMP在断奶仔猪饲粮中添加0.5～400 mg/kg，获得良好的促生长效果，提高体增重4%～40%、平均日增重7%～53%、饲料转化效率3%～18%，降低腹泻率2%～46%[31-36]。进一步研究发现，大肠杆菌素、Microcin J25和cecropin AD等AMP能降低肠道大肠杆菌数量，增加乳酸菌和双歧杆菌的数量[32-33，36-37]，提示AMP能通过改善肠道微生态平衡，促进断奶仔猪肠道健康。肠道结构的完整性是营养物质消化吸收和肠道健康的基础。研究发现，cecropin AD和防御素能增加断奶仔猪小肠绒毛高度，降低隐窝深度，维护肠道屏障完整性[34-35]。同时，Microcin J25和人工合成AMP还能够降低血清、肠道中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等含量，增加免疫球蛋白SIgA和IgG表达[33，36]。以上表明，AMP对断奶仔猪不仅具有促生长作用，还能通过调节肠道微生物平衡、维持肠道屏障完整性和调节机体炎症反应等多方面提高机体免疫力。

3.2 肉鸡

现代规模化养殖的肉鸡品种因生长速度快而抗病力差。研究发现蛙皮素尼生素（nisin）、骆驼乳铁蛋白“36”、骆驼乳铁蛋白（chimera）、兔防御素NP-1、Sublancin、天蚕素、抗菌肽A3和P5、菌丝霉素、MccJ25、Piscidins和神经毒素Ctx（Ile21）-Ha等AMP能提高肉鸡生长性能和免疫力[38-42]。Zhang等[39]在肉鸡饲粮中添加菌丝霉素，使均平日增重和饲料转化效率分别提高17%和20%。肉鸡在幼雏阶段免疫抵抗力差，死亡率高，而饲粮添加20 mg/kg或40 mg/kg神经毒素Ctx（Ile21）-Ha能抑制肠炎链球菌和鼠伤寒链球菌的感染，降低雏鸡死亡率[38]。肉鸡生长周期短，营养物质消化吸收和肠道健康水平直接影响着肉鸡生长性能和经济效益。Ma等[43]研究表明，饲粮中添加100 mg/kg或200 mg/kg的菌丝霉素能提高十二指肠脂肪酶和胰蛋白酶的活性，促进营养物质吸收，改善肠道形态，促进肠道健康。菌丝霉素和MccJ25还能降低肠道内病原菌大肠杆菌和沙门氏菌数量，维持肠道微生物平衡[39-40]。研究还发现，饲粮中添加菌丝霉素可提高21日龄和35日龄黄羽肉鸡H9N2禽流感病毒和新城疫病毒抗体水平，降低回肠大肠杆菌数量，抑制回肠中促炎细胞因子表达[39]。MccJ25能降低肉鸡血液中促炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度[40]，Piscidins能增加血液中抗炎因子IL-10和IFN-γ的含量[41]。因此，AMP在促进肉鸡生长的同时还能提高机体免疫力。

最近，Sholikin等[44]系统分析了29项AMP在肉鸡上的应用试验，发现AMP添加水平对肉鸡体重、平均日增重和饲料转化系数的影响呈二次曲线关系，死亡率呈线性降低，代谢能呈线性增加，十二指肠绒毛高度、绒隐比呈线性增加，隐窝深度呈线性降低，空肠黏膜厚度呈二次曲线变化，隐窝深度呈线性下降。添加AMP可降低回肠中大肠菌群和总需氧菌的数量、盲肠中梭菌和大肠杆菌数量以及粪便中梭状芽孢杆菌数量。而且，饲喂AMP使肉鸡IgM、T细胞分化抗原4（CD4）、新城疫抗体滴度、法氏囊指数、脾脏指数和胸腺指数均显著升高，超氧化物歧化酶活性有升高的趋势[45]。类比分析表明，AMP对肉鸡生产性能的影响与抗生素相当，较空白对照组有明显的改善。可见，AMP作为促生长剂可有效替代抗生素，提高肉鸡生长性能、养分消化率、肠道健康和免疫功能。

4 展望

AMP不仅具有良好的抗微生物活性，还具有调节免疫、增强肠道健康和促进生长等功能，作为理想的饲用抗生素替代品在畜牧生产中具有广阔的应用前景。然而，AMP的应用与推广仍存在很多限制因素，主要包括：①损伤真核生物细胞膜，引起溶血副作用；②生产成本高；③容易被蛋白酶降解；④在动物胃肠道内的稳定性较差；⑤在某些血清和铁存在的情况下，活性降低。因此，理想的AMP应满足以下特性：抗菌活性高、对哺乳动物膜毒性低、稳定性好、低血清结合能力，且易于获取和低成本生产。未来应着重从链长、二级结构、净电荷、疏水性、两亲性五个方面进行AMP设计和改造，可以采用定点突变、从头设计、基于模板设计、基于现有AMP组装、化学修饰、计算机设计等方法，从源头上解决AMP稳定性、安全性和经济性的问题，也需进一步深入揭示AMP作用的基础理论，为AMP合理开发与科学应用奠定基础。