吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者痰液中蛋白激酶R样内质网激酶、真核翻译起始因子2α水平与疾病严重程度及肺功能的关系

穆迪 王金亮 葛须鑫

目前，吸烟是诱发慢性阻塞性肺疾病(COPD)最主要的独立危险因素已得到普遍认可[1-2]。香烟中的自由基和毒性物质可促使肺泡上皮细胞发生内质网应激诱导性凋亡[3]。甘桂香等[4]发现吸烟所致COPD模型大鼠，肺损伤组织中蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)水平明显升高。虽然从动物实验角度分析，内质网应激很可能是诱发COPD炎症反应的重要机制，但尚缺乏人体试验证据。PERK-eIF2α信号通路是内质网应激反应中早期被激活的通路之一[5]，考虑到COPD患者肺组织标本来源有限，我们尝试通过检测痰液中PERK和eIF2α水平，分析其与疾病严重程度及肺功能的相关性，为指导临床诊断和个体化治疗提供理论依据。

对象与方法

1.对象：2018年5月～2019年5月于我科就诊的COPD患者107例，其中男78例，女29例，年龄34～82岁，平均年龄(60.53±13.96)岁。根据吸烟情况，将患者分为吸烟组和非吸烟组。纳入标准：(1)吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2018年修订版)》[6]关于COPD的诊断标准，根据该指南中的分期标准将吸烟组和非吸烟组患者分别分为急性加重期组和稳定期组；(2)具备完整肺功能资料；(3)神志清楚，无精神障碍。排除标准：(1)近3个月内除肺组织外其他组织的急慢性感染；(2)支气管哮喘、肺间质纤维化、活动性肺结核病史；(3)近半年内接受手术治疗。根据是否吸烟(WHO将吸烟定义为每天吸烟>1支，且连续吸烟超过1年)将所有患者分为吸烟组63例和非吸烟组44例。本研究经我院伦理委员会审核批准(20180511)，所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)诱导痰液检查：我院诱导痰液检查采取定时法。所有患者提前1天停用止咳药物，诱导前10 min吸入沙丁胺醇400 μg，超声雾化吸入3%的高渗盐水15 min后，深咳取痰液中的黏稠部分，置于无菌痰盒中。若痰量不足，可继续递增高渗盐水浓度，超声雾化吸入7 min，继续采集痰液样本。弃痰液中稀薄部分后于显微镜下观察，每低倍视野WBC计数>25个且鳞状上皮细胞计数<10个或鳞状上皮细胞计数/WBC计数<1∶2.5，则为合格痰标本，可用于PERK和eIF2α的检测。

(2)痰液中PERK和eIF2α水平检测：于痰液标本中加入二硫苏糖醇混匀，采用300目尼龙网过滤后以3 000 r/min离心10 min，取上清液,采用人PERK酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和人eIF2α ELISA试剂盒检测PERK和eIF2α水平。PERK ELISA试剂盒购于加拿大PL Laboratories公司(货号：PL0304700)，eIF2α ELISA试剂盒购于美国BIOHJSW公司(货号：orb-EHJ127804)。

(3)肺功能检查：参考《肺功能检查指南(第二部分)-肺量计检查》[7]，采用VS229型肺功能测试仪检测肺功能指标，包括FEV1、FVC、FEV1/FVC。每次测试均重复≥3次，选用图形及数据最好的1次，以减少数据误差，提高准确性。根据FEV1占预测值的百分比(FEV1%pred)进行慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)分级。GOLD 1级：FEV1%pred≥80%，疾病严重程度为轻度；GOLD 2级：FEV1%pred 50%～79%，疾病严重程度为中度；GOLD 3级：FEV1%pred 30%～49%，疾病严重程度为重度；GOLD 4级：FEV1%pred<30%，疾病严重程度为极重度。

(4)生活质量评估：采用慢性阻塞性肺疾病评分(CAT)评估患者生活质量。由我科医务人员负责发放问卷和统计结果，问卷由患者独立完成。

结 果

1.两组患者临床资料比较：吸烟组患者吸烟指数为(689.74±203.18)支/年。吸烟组和非吸烟组患者性别、年龄、BMI、FEV1/FVC、FEV1%pred及CAT评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者临床资料比较

2.两组患者痰液中PERK、eIF2α水平比较:吸烟组患者痰液中PERK和eIF2α水平均高于非吸烟组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者痰液中PERK、eIF2α水平比较

3.吸烟组和非吸烟组不同疾病状态患者痰液中PERK、eIF2α水平比较：吸烟组中，急性加重期组患者痰液中PERK和eIF2α水平均高于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)。非吸烟组中，急性加重期组和稳定期组患者痰液中PERK、eIF2α水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 吸烟组和非吸烟组不同疾病状态患者痰液中PERK、eIF2α水平比较

4.吸烟组不同疾病严重程度患者痰液中PERK、eIF2α水平比较：吸烟组中，GOLD 1级组、GOLD 2级组、GOLD 3级组及GOLD 4级组患者痰液中PERK、eIF2α水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着GOLD分级的增加，痰液中PERK、eIF2α水平逐渐升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 吸烟组不同疾病严重程度患者痰液中PERK、eIF2α水平比较

5.吸烟组患者痰液中PERK、eIF2α水平与肺功能的相关性：Pearson相关分析结果显示，吸烟组患者痰液中PERK水平与eIF2α水平呈正相关(r=0.386，P=0.002)，痰液中PERK水平与FEV1%pred呈负相关(r=-0.638，P<0.001)，但与FEV1/FVC无相关性(r=-0.095，P=0.469)；痰液中eIF2α水平与FEV1%pred呈负相关(r=-0.445，P<0.001)，但与FEV1/FVC无相关性(r=-0.045，P=0.717)。

讨 论

COPD患者肺损伤的机制尚不明确[8]。慢性炎症假说、蛋白酶-抗蛋白酶失衡假说、线粒体基质障碍等均存在争议。2015年中国疾病预防控制中心慢病中心对全国范围开展的COPD流行病学调查研究结果显示，吸烟是COPD的主要致病因素，被动吸烟、粉尘接触、呼吸道疾病史等是引起COPD的重要高危因素[9-10]。但对于吸烟的COPD患者，炎症机制并不能完全解释COPD病情进展。如在临床治疗中，与其他气道炎症疾病(如肺炎、哮喘等)不同的是，抗炎药物并不能完全阻止COPD进展[11]。因此，从其他发病机制角度寻找生物学指标对于指导COPD的临床诊疗十分重要。

近些年，有学者从细胞和分子水平证实香烟烟雾中的氧化物质和有害物质可通过内质网应激机制诱导肺组织细胞凋亡，导致肺上皮组织屏障损伤，从而可能诱发COPD[12]。内质网是维持真核生物新陈代谢的重要细胞器，对氧化应激反应十分敏感，若细胞发生氧化-抗氧化失衡，内质网合成-折叠蛋白功能受损，未折叠蛋白或错误折叠蛋白大量聚集，从而导致内质网应激[13]。而未折叠或错误折叠的蛋白与葡萄糖调节蛋白78结合，激活PERK-eIF2α信号通路，反馈性缓解内质网应激状态[14]。eIF2α是真核生物中具有高度保守结构的蛋白质，可与很多关键激酶结合，抑制下游相关基因转录和翻译，并促使多种新生多肽主动自内质网中释放，从而减轻内质网应激反应[15]。而PERK是eIF2α的上游激活分子，在内质网应激状态下，PERK被激活，通过磷酸化eIF2α抑制下游蛋白的翻译，减少非折叠蛋白反应[16]。且PERK、eIF2α可被释放至细胞外，在循环血液和痰液样本中均可被检测到[17]。在前期预实验中，我们采用ELISA检测，结果发现痰液中PERK、eIF2α水平较外周血清高，可能与血液中存在大量蛋白酶，易降解PERK、eIF2α有关，因此在本研究中我们选择痰液样本。本研究结果显示，吸烟组患者痰液中PERK和eIF2α水平均高于非吸烟组，表明内质网应激反应可能是吸烟引起COPD的主要机制之一。另外，我们在选取患者时，不仅包含急性发作期患者，还有部分患者处于稳定期，进一步分层分析结果显示，吸烟组中，急性发作期组患者痰液中PERK和eIF2α水平均高于稳定期组，而非吸烟组中，急性发作期组和稳定期组患者痰液中PERK、eIF2α水平比较差异均无统计学意义，推测在吸烟的COPD患者中，内质网应激可能是疾病进展的重要机制。本研究结果显示，吸烟组中，随着GOLD分级增加，COPD患者痰液中PERK、eIF2α水平逐渐升高，且痰液中PERK、eIF2α水平与FEV1%pred均呈负相关，进一步证实内质网应激反应可反映吸烟的COPD患者的疾病严重程度。

综上所述，香烟烟雾中的氧自由基或有害颗粒可能通过激活肺组织上皮细胞内质网应激促进肺组织细胞损伤/凋亡，进而促使并加重COPD的发生和发展。检测痰液中PERK和eIF2α水平可能反映吸烟COPD患者的疾病状态，对于临床诊疗有一定的参考价值。