人乳头瘤病毒基因亚型与宫颈病变的相关性及临床意义分析

陈彩霞

湖北省十堰市郧阳区人民医院检验科 442500

女性常见恶性肿瘤当中发病率位居第二的就是宫颈癌，位居首位的是乳腺癌[1]。世卫组织报道指出，每年的发病数量有约50万；而在中国每年宫颈癌的新发病例约14万，对女性的生活及生命质量都产生了严重影响[2]。随着临床研究的不断深入，人乳头瘤病毒(HPV)开始逐渐进入到临床对宫颈癌的研究中，且经过近几年研究指出，感染HPV是导致女性出现宫颈病变的一项主要原因[3]。目前临床中已经发现并证实的HPV基因亚型大概有100多个，其中，跟人类生殖道相关疾病有联系的约40多个[4]。依据HPV基因亚型的不同致病能力，其主要分为低危型和高危型。感染HPV跟机体免疫功能、性活跃程度及年龄都存在十分密切的联系。本研究采用PCR反向点杂交技术检测HPV的基因亚型，探讨宫颈病变与HPV不同亚型之间的关系，为宫颈疾病的预防和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1—12月我院妇科864例宫颈病变患者为观察对象，患者年龄18～60岁，平均年龄(38.6±1.3)岁。所有患者经过HPV检测和宫颈病理活检。

1.2 仪器与试剂 PCR 扩增仪：罗氏480全自动实时荧光定量PCR仪。分子杂交仪：深圳亚能Combi-H12分子杂交仪。HPV基因分型检测试剂盒：深圳亚能生物技术有限公司生产的人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)。

1.3 实验方法

1.3.1 HPV-DNA标本的采集：以专用宫颈脱落细胞采集器进行采集，医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，取出宫颈刷置于宫颈口，单向旋转4～5周以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好标识并直立放置。统一送至实验室进行检测。

1.3.2 HPV-DNA的提取：充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干，取1ml洗脱液转移到1.5ml离心管中，13 000r/min，离心10min，弃去上清液，保留管底的细胞沉淀。加入50μl裂解液悬浮沉淀，沸水浴加热10min。13 000r/min，离心10min，保留上清液待用。

1.3.3 PCR扩增：取出PCR反应管，在管盖上做好标记，低速离心数秒，分别加入已提取的待测样本DNA 5μl，反应总体积为25μl(可加入1滴矿物油防止蒸发)，低速离心数秒。每次实验可设置一个阴性质控和一个阳性质控，作为产品使用的质量控制。PCR按以下条件进行扩增：50℃ 15 min；95℃ 10 min；然后以94℃ 30s；42℃ 90s；72℃ 30s，40个循环；72℃延伸5min。

1.3.4 杂交：取15ml塑料离心管，放入标有样本标号的膜条(应在膜条处用中性笔标记)，加入A液5～6ml及所有(25μl)的PCR扩增产物。将离心管放入沸水加热10min(确保A液液面完全位于沸水液面以下)，取出再放入杂交箱51℃杂交至少1.5h。取出50ml塑料离心管，加入50ml B液，于杂交箱或水浴箱中预热至51℃。阴性质控品和阳性质控品同步处理。

1.3.5 洗膜：取出膜条，移至装有B液的50ml离心管中，于51℃轻摇洗涤5min。

1.3.6 显色及HPV结果判定：按照HPV-DNA检测试剂盒说明进行杂交显色，显色结果按照说明书进行判断。膜条上探针按照规定序列排列，由蓝色斑点显现位置可判断HPV的亚型。其中高危型18种包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，83，MM4。低危型5种包括HPV6，11，42，43，44。感染HPV:一种HPV-DNA亚型出现阳性；多重感染：两种及两种以上HPV-DNA亚型出现阳性。

1.3.7 宫颈组织病理活检：正常或炎症：样本检测结果提示仅存在炎症或者正常；CINⅠ：轻度不典型增生；CINⅡ：中度不典型增生；CINⅢ：重度不典型增生；宫颈癌[5]。

1.4 观察指标 (1)观察所有人群的宫颈活检结果及HPV阳性检出比率。(2)观察不同宫颈病变当中的HPV常见基因亚型的分布情况。(3)观察不同宫颈病变当中单一HPV基因亚型感染及多重HPV基因亚型感染情况。

1.5 统计学方法 应用SPSS22.0软件进行统计分析，计数资料以率(%)表示，进行χ2检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 所有人群的宫颈活检结果及HPV阳性检出比率 864例当中，正常或炎症宫颈：620例，CINⅠ：58例，CINⅡ：36例，CINⅢ：88例，宫颈癌：62例。HPV阳性比率随着宫颈病变程度的不断加重而升高(P<0.05)，具体见表1。

表1 所有人群的宫颈活检结果及HPV阳性检出比率

2.2 不同宫颈病变当中的HPV常见基因亚型的分布情况 不同类型的宫颈病变当中，HPV基因分型感染情况各不相同，前三位HPV基因为：CINⅠ：HPV-16型、HPV-33型、HPV-18型；CINⅡ：HPV-16型、HPV-18型；CIN Ⅲ：HPV-16型、HPV-58型、HPV-33型；宫颈癌：HPV-16型、HPV-33型、HPV-52型。

HPV常见亚型在不同宫颈病变当中的感染情况：HPV-l6型在正常或炎症当中的检出率为10.0%、在CINⅠ当中的检出率为13.8%，CINⅡ当中的检出率为38.9%，CINⅢ当中的检出率为34.1%，在宫颈癌当中的检出率为77.4%。HPV-52型在不同宫颈病变当中的感染分别为：正常或炎症：2.6%、CINⅠ：0%、CINⅡ：0%、CINⅢ：4.5%、宫颈癌：6.5%。HPV-58型在不同宫颈病变当中的感染分别为：正常或炎症：1.3%、CINⅠ：0%、CINⅡ：5.6%、CINⅢ：13.6%、宫颈癌：0%。

伴随病情的不断发展，HPV-16型在不同宫颈病变当中的感染比率逐渐升高，在宫颈癌患者当中同样也是HPV-16型的比率优势显著，为77.4%(48/62)，具体见表2。

表2 不同宫颈病变当中的HPV常见基因亚型的分布情况

2.3 不同宫颈病变当中单一HPV基因亚型感染及多重HPV基因亚型感染情况 宫颈癌当中的HPV多重感染占比明显更少，在宫颈癌当中更多的是单一HPV基因型感染，且感染类型全部为高危分型，表示宫颈癌的一个显著特点为高危型单一HPV感染，具体见表3。

表3 不同宫颈病变当中单一HPV基因亚型感染及多重HPV基因亚型感染情况[n(%)]

3 讨论

目前临床当中已经充分明确了宫颈癌跟HPV之间的关系。HPV在早期的复制及表达时会出现E6癌蛋白和E7癌蛋白；而在HPV晚期时则会出现衣鞘蛋白Ll和衣鞘蛋白L2[6]。假如机体持续性的感染HPV，在早期时出现表达的E6癌蛋白就会使得p53分解水平显著增加，进而使得宫颈细胞所具有的特异性也明显增加。E7癌蛋白会对E2F/pRb这一复合物产生干扰作用，主要作用是使得拥有重要作用的转录因子E2F能够被激活，导致发生翻译异常及HPV转录[7]。当损伤DNA时，就会导致宫颈病变持续加重。本次研究结果提示，HPV阳性比率随着宫颈病变程度的不断加重而升高(P<0.05)。而在宫颈癌当中HPV的阳性比率更是高至90.3%，这与类似研究结果一致。

本次研究结果提示，不同类型的宫颈病变当中，HPV基因分型感染情况各不相同。研究结果提示，不同亚型的高危HPV基因其潜在的致病能力也各不相同，同时也反映了在不同宫颈病变当中的流行性特征。在相关研究当中指出，宫颈癌及CIN当中最常见的一种HPV基因亚型就是高危型HPV-16型，这与本次研究结果一致[8]。本次研究结果提示，在宫颈癌患者当中同样也是HPV-16型的比率优势显著，为77.4%(48/62)。相关研究指出，连续性的感染同一高危型HPV基因而导致的持续性感染，引发宫颈癌的风险最大。还有研究指出，针对常见的几种高危型HPV基因亚型：HPV-16型、HPV-18型、HPV-31型、HPV-33型实施动态持续性的检测，结果提示，HPV-16型与其他HPV基因亚型相比所展现出的持续性感染更加明显[9]。本次研究结果提示，伴随病情的不断发展，HPV-l6型在不同宫颈病变当中的感染比率逐渐升高。分析其原因可能为HPV-16型更加容易导致发生持续性的感染，且机体很难将其进行清除[10]，且HPV-16型是研究当中最常见的一种宫颈癌HPV基因亚型，一定要引起临床的重视及关注。

综上所述，随着宫颈病变程度的不断加重，HPV的阳性比率也随之逐渐升高；宫颈癌当中的HPV基因亚型主要包括：HPV-16型、HPV-58型、HPV-18型。