vaspin、11β-HSD和IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盘组织中的表达及其临床意义

黄 娟

香港大学深圳医院,广东省深圳市 518000

妊娠期糖耐量异常表现为胰岛素抵抗(IR)和糖代谢异常[1]。vaspin是一种新胰岛素增敏脂肪细胞因子，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。近来相关研究认为其与T2DM存在一定的关系[2]。11β-HSD是参与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)预调节的重要代谢酶，其至少包括两种亚型：11β-HSD1和11β-HSD2[3]。在体外培养中，IL-6上调了脂肪细胞内脂素的表达，但抑制了其在小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪)(3T3-L1细胞)中的表达，提示IL-6可能对脂肪细胞因子起调节作用[4]。本文研究对vaspin、11β-HSD和IL-6在妊娠期糖尿病患者胎盘组织中的表达情况进行了分析，并探讨了上述三者的相关性，旨在为临床提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年1—6月于我院产科行择期剖宫产的40例孕妇作为研究对象。纳入标准：(1)择期剖宫产(非急诊因素剖宫产，如顺产中转剖宫产等，尽量减少宫内感染因素)；(2)术中见羊水清(排除羊水粪染)；(3)排除合并各个系统的感染性疾病，比如呼吸系统感染、泌尿生殖系统感染等；(4)孕妇签字已放弃胎盘。排除标准:(1)血糖控制不达标，或有酮症、酮症酸中毒病史；(2)合并高血压、肝肾功能异常、多囊卵巢综合征、胎膜早破等；(3)妊娠前有糖尿病史。按孕妇有无GDM分为GDM组(20例)和非GDM组(20例)。GDM组早孕期血糖正常，孕24～28周 75g糖OGTT结果符合国际糖尿病研究协会制定的GDM标准，平均分娩孕周为(38.8±0.8)周，平均年龄为(32.0±3.4)岁；非GDM组早孕期血糖正常，孕24～28周， 75g糖OGTT提示阴性，分娩平均孕周为(39.2±0.7)周，平均年龄为(33.3±4.3)岁。 两组孕妇的一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 vaspin、11β-HSD及IL-6的测定

1.2.1 标本收集及处理：胎盘娩出后，在无菌操作下，从胎盘母体面中央位置取1.0cm组织方块，用0.9%氯化钠水溶液将其冲洗后置于EP管中，快速移至装有液氮的冰壶中，置于-80℃冰箱储存待检。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR法：检测胎盘组织中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2及IL-6 mRNA表达:(1)按总RNA提取试剂盒[购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司]说明书提取胎盘组织的总RNA，并鉴定其纯度和浓度。(2)按逆转录试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)说明书合成RNA的互补DNA:反应体系10μl。反应条件:37℃逆转录反应15min,再85℃5min灭活逆转录酶。(3)按美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库中相关因子的NM序列号，设计合成引物，引物均由美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen)合成。本次实施荧光定量RT-PCR实验引进内参基因为GAPDH。引物序列见表1。(4)PCR反应体系:严格按试剂盒说明书操作，2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDN A 8μl。(5)结果分析，以GAPDH作为内参，采用京科瑞达ABI7900荧光定量PCR仪计算vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2、IL-6 mRNA的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 BeWo细胞培养及细胞中vaspin含量测定 BeWo细胞购自誉弛(上海)生物科技有限公司，采用F-12K培养液，含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在37℃、5%CO2、饱和湿度、pH 7.4孵育箱培养BeWo细胞，0.25%胰酶消化传代，每3d换液传代。接种BeWo细胞于六孔板中，1×106/孔，分别加入1、5、10ng/ml的IL-6，设置空白组。分别对不同浓度的IL-6设定时间梯度为12h、24h、48h、72h。收集不同浓度和时间的IL-6细胞，置于-80℃冰箱冷冻保存。用RT-PCR法分别测定细胞中vaspin含量，用有效作用浓度的IL-6作用BeWo细胞48h后，采用Western免疫印迹(WesternBlot)对细胞中vaspin蛋白表达情况进行分析。

1.4 A549细胞培养及细胞上清液中IL-6含量测定 将4×105个A549细胞铺于T25细胞培养瓶中,置于含体积分数为0.01胎牛血清的DMEM-1640培养基中，37℃,5%CO2孵箱中培养24h后按脂质体转染试剂说明书进行转染，脂质体用量分别为6μl，重组质粒用量为3μg，用无血清和抗生素的培养液转染，转染后5h换成有血清和抗生素的培养液。将转染后48h收取的细胞上清严格按EIISA试剂盒说明书测定IL-6含量。

2 结果

2.1 两组胎盘组织中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2及IL-6 mRNA及蛋白表达水平比较 两组胎盘组织vaspin mRNA及蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)；GDM组IL-6 mRNA及蛋白表达水平均明显高于非GDM组，差异均有统计学意义(P<0.05)；GDM组胎盘11β-HSD1 mRNA和蛋白的表达明显低于非GDM组差异均有统计学意义(P<0.05)；11β-HSD2 mRNA和蛋白表达水平明显高于非GDM组(P<0.05)。见表2。

表2 两组胎盘组织中vaspin、11β-HSD1、11β-HSD2 及IL-6 mRNA及蛋白表达水平比较

2.2 IL-6对BeWo细胞vaspin表达的影响 不同浓度的IL-6(1、5、10ng/ml)对BeWo细胞vaspin mRNA表达有抑制作用，10ng/ml浓度作用最明显；10ng/ml IL-6在12、24、48、72h均可抑制BeWo细胞vaspin mRNA的表达，48h效果最明显，蛋白表达也显著降低，见图1。

图110ng/mlIL-6分别作用BeWo细胞不同时间点对

BeWo细胞中vaspinmRNA表达的影响

2.3 11β-HSD1、11β-HSD2重组质粒在A549细胞中表达的检测 将重组质粒瞬时转染A549细胞48h后，His抗体在转染重组质粒细胞中可检测到11β-HSD1和11β-HSD2的表达，而空载体转染的细胞中没有靶蛋白。转染空载体和未经处理的细胞上清液中IL-6水平无显著性差异(P>0.05)；转染空载体的细胞上清液中IL-6的水平低于转染11β-HSD2重组质粒的细胞上清液中IL-6的水平(P<0.05)，转染空载体的细胞上清液IL-6水平高于转染11β-HSD1重组质粒的细胞上清液中IL-6的水平(P<0.05)，见图2。

图2ELISA测定细胞上清中的IL-6表达水平

3 讨论

GDM可引起子痫前期、巨大儿、肩难产、新生儿湿肺、新生儿高胆红素血症等母婴并发症，严重影响母婴健康和生命安全。当前，GDM的发病机制与IR存在一定的关系。vaspin是一种新的胰岛素增敏脂肪细胞因子，与IR存在紧密的关联，近来有研究认为其与T2DM的发生有关[5-6]。GDM患者vaspin水平存在差异的研究结果存在差异。本文研究结果显示，GDM组胎盘组织vaspin表达水平与非GDM组比较，无显著差异(P>0.05)。

IL-6是一种由T细胞、脂肪细胞、B细胞等多种细胞合成的多功能细胞因子。是患者炎症反应十分关键的细胞因子。IL-6在GDM发病中的作用机制可能是：(1)抑制糖原合成酶，刺激肝糖原释放，导致血糖升高；(2)诱导瘦素抵抗，并通过与瘦素共享信号转导途径抑制瘦素信号转导，降低了对胰岛素分泌的抑制作用；(3)通过肝细胞作用抑制胰岛素受体底物-1(Insulin receptor substrate，IRSs-1)酪氨酸磷酸化，导致IR。IL-6是GDM发病过程中十分关键的脂肪细胞因子[7-9]。本文研究显示，GDM组IL-6表达水平高于非GDM组(P<0.05)。与相关研究结果一致。

本文研究发现不同浓度的IL-6对BeWo细胞vaspin mRNA表达有抑制作用，10ng/ml浓度作用最明显；10ng/ml IL-6在不同时间点均可抑制BeWo细胞vaspin mRNA的表达，48h效果最明显，蛋白表达也显著降低。相关研究发现，GDM组孕中期血清vaspin略降低、而IL-6水平升高，vaspin与IL-6呈负相关关系，因此认为，脂肪细胞因子vaspin受炎症因子IL-6的影响[8-10]。IL-6调节IR的机制尚未明确，当前产生了两种理论分歧：(1)IL-6升高可影响肝细胞IR，促进全身性IR的发展。(2)体外研究显示，在胰岛素信号转导途径和糖代谢负向调节过程中，IL-6是脂肪细胞的作用靶点[11-12]。

本文研究还发现转染空载体的细胞上清与未处理的细胞上清相比IL-6水平无显著差异(P>0.05);转染空载体的细胞上清IL-6水平低于转染11β-HSD2重组质粒的细胞上清IL-6水平(P<0.05)，转染空载体的细胞上清IL-6水平高于转染11β-HSD1重组质粒的细胞上清IL-6水平(P<0.05)。11β-HSD对于调节GR前作用十分关键，其包括11β-HSD1和11β-HSD2两个亚型，通常认为11β-HSD1可提升GR浓度和活性，保护内皮细胞免受GR的炎性损伤，而11β-HSD2会降低GR浓度和活性，增大GR对内皮细胞的损伤[13-14]。有研究结果显示，在川崎病患儿急性期，11β-HSD1 mRNA水平较对照组明显升高，同时11β-HSD2 mRNA水平较对照组明显降低，提示11β-HSD活性改变是川崎病急性期炎症反应的重要调节因子[15-17]。

综上所述，GDM组与非GDM组vaspin mRNA和蛋白表达无显著性差异，IL-6可抑制BeWo细胞vaspin的表达，提示vaspin与炎症存在一定的关系。GDM组11β-HSD1低表达，11β-HSD2高表达。它们与胰岛素、脂质代谢紊乱及胎盘炎症反应相关，但其具体作用机制尚需进一步完善。