麸炒白术配方颗粒HPLC指纹图谱研究

姚 娜，黄燕明，汪 静，李雪银，陈桂生，王 斌，康志英，3

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300；3.广东香雪南药发展有限公司，广东 肇庆 526642)

麸炒白术为白术饮片经蜜炙麸皮炮制加工制成。白术为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，冬季下部叶枯黄、上部叶变脆时采挖，除去泥沙，烘干或晒干，再除去须根，即得。白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，临床上多用于脾虛食少、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安的治疗[1-2]。白术经麸炒后，健脾消食作用得以增强[3]。目前，麸炒白术药理活性的研究主要围绕抗衰老、调节免疫、利尿、调节肠胃功能以及抑制肿瘤细胞等方面展开[4]。麸炒白术主要含有挥发油、白术多糖、内酯类、氨基酸、微量元素和蒲公英萜醇乙酸酯等成分，其中挥发油、白术多糖和内酯类是麸炒白术的主要有效成分[5-8]。虽然已有文献[9]对麸炒白术配方颗粒的特征图谱进行研究并确定了8个特征峰，但是未对其特征峰进行指认。因此，本文采用HPLC法建立了麸炒白术指纹图谱，确立了12个共有峰，并采用液质联用技术(LC-MS)对8个共有峰进行指认，从整体上评价其工艺和质量，以提高麸炒白术配方颗粒的质量评价水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290型超高效液相色谱(UPLC)，连接6530型四级杆-飞行时间串联质谱仪(Q-TOF-MS)，配有两个独立二元泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)和电喷雾离子源(ESI)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；MS204TS万分之一电子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；KQ500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

白术对照药材(批号：120925-201611)，购自中国食品药品检定研究院；咖啡酸(批号：110885-200102)，购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A(批号：151028)、异绿原酸B(批号：150327)、异绿原酸C(批号：150724)均购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈(天津赛孚瑞公司，色谱级)；甲酸(天津市光复精细化工厂，分析纯)；甲醇(北京化工厂，分析纯)；乙酸乙酯(北京化工厂，分析纯)；水为娃哈哈纯净水。

1.3 样品

共收集18批白术饮片，其中安徽亳州6批，浙江东阳3批，浙江磐安2批，河北安国3批，湖南龙山2批，河南温县2批。样品经广州市香雪制药股份有限公司高级工程师康志英鉴定为真品。参照2015年版《中国药典》麸炒白术炮制方法将18批白术饮片炮制成麸炒白术饮片，由本实验室根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》，研究麸炒白术配方颗粒的制备工艺，并按照确定的制备工艺制成18批中试批量的麸炒白术配方颗粒。

2 方法与结果

2.1 麸炒白术配方颗粒指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters Symmetry®-C18色谱柱(柱长为250 cm，柱内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以乙腈为流动相A，以0.5%甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为313 nm，洗脱条件见表1。

2.1.2 参照物溶液制备 取白术对照药材约1.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加水25 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，用乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

表1 梯度洗脱条件

2.1.3 供试品溶液制备 取本品约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加水25 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次25 mL，收集乙酸乙酯部分，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5 mL量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 指纹图谱方法学考察

2.2.1 专属性试验 取麸炒白术配方颗粒，按照“2.1.3”项下供试品溶液的方法制备，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果12个共有色谱峰均不受溶剂因素干扰，专属性良好。

2.2.2 精密度试验 取上述麸炒白术配方颗粒样品，按色谱条件测定，连续进样6次，每次10 μL，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，相似度均大于0.90，表明该仪器的精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取同一批麸炒白术配方颗粒样品，平行6份，按照“2.1.3”项下供试品溶液的方法制备，依法测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，相似度均大于0.90，表明该分析方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h进样分析，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，相似度均大于0.90，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3 指纹图谱的构建

取18批麸炒白术配方颗粒，按供试品溶液制备方法和色谱条件测定，得到18批麸炒白术配方颗粒的色谱叠加图(见图1)。根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出的原则，选择了12个特征峰作为共有峰。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，结果相似度均大于0.90。

2.4 共有峰的指认

通过质谱检测对麸炒白术配方颗粒指纹图谱中的共有峰进行指认。

2.4.1 供试品溶液制备 同“2.1.3”项下方法制备供试品溶液。

2.4.2 色谱条件 色谱分离采用Agilent Eclipse Plus C18UPLC色谱柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)，配有在线过滤器。柱温：40 ℃，流速：0.5 mL/min，流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈。梯度洗脱程序：0～3 min (5% B)，3～5 min (5%～10% B)，5～10 min (10%～15% B)，10～13 min (15%～24% B)，13～17 min (24%～30% B)，17～20 min (30%～35% B)，20～23 min (35%～41% B)，23～27 min (41% B)，27～28 min (41%～100% B)，28～32 min (100% B)，后运行时间10 min。检测波长：313 nm，每次进样：3 μL。

图1 18批麸炒白术配方颗粒HPLC叠加

2.4.3 质谱条件 分别在正、负离子模式下进行，干燥气温度325 ℃，干燥气流速6 L/min，雾化气压力45 psi，毛细管电压3 500 V(正模式)和3 000 V(负模式)，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min。一级质谱质量扫描范围50～1 100m/z。二级质谱选用Target-MS/MS模式，碰撞电压10和30 eV。所得LC-MS数据由Agilent MassHunter软件采集。

2.4.4 质谱分析 精密吸取麸炒白术配方颗粒供试品溶液注入LC-MS仪，按上述条件进行检测，根据麸炒白术配方颗粒供试液的UPLC-UV色谱图和UPLC-TOF-MS总离子流图(正、负模式)，图中标识的1～16号色谱峰物质，均得到了良好的分离和检测(见图2)。

通过高分辨TOF-MS的精确质量数测定，对上图中1-16号峰物质进行了鉴定，结合在正模式下生成[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+等加合离子，和负模式下生成 [M-H]-加合离子的情况，推断出化合物的精确分子量和分子式，结果见表2。

表2 麸炒白术配方颗粒UPLC-Q-TOF-MS分析

续表2

通过质谱检测结果结合参考文献比对分析，共推断出13个色谱峰的化学结构。由于液质联用仪的液相部分为UPLC，其色谱图与HPLC的色谱行为有些差异。通过对照品比对4个已知成分咖啡酸、异绿原酸A、B、C，分析结果与质谱结果一致。12个HPLC共有峰中指认了其中8个已知成分。质谱分析结果与共有峰指认结果对应关系见表3。

2.4.4 对照图谱的建立 取18批麸炒白术配方颗粒，按供试品溶液制备方法和色谱条件测定，通过质谱检测和对照品比对，生成的对照指纹图谱见图3。

表3 质谱分析结果与共有峰指认结果对应关系

峰1：对羟基苯甲酸；峰2：咖啡酸；峰5：东莨菪内酯；峰6：异绿原酸B ；峰7：异绿原酸A ；峰8：异绿原酸C ；峰9：刺五加酮；峰10：洋蓟素

3 讨论

采用光电二极管阵列检测器考察麸炒白术配方颗粒供试品溶液在不同波长下色谱图情况。供试品溶液在190～400 nm波长下进行扫描，通过3D视图和等吸收图谱进行分析，结果显示在250～330 nm波长范围内，基线平稳，信息量较大。选取其中常见波长进行分析，313 nm下各色谱峰响应值适中，分离度良好，故最终确定以313 nm为检测波长。

供试品提取溶媒考察对比了水提取与乙酸乙酯萃取的效果。结果发现，经乙酸乙酯萃取富集后，色谱图中信息量较大，故采用乙酸乙酯萃取的方法制备样品。

考虑到指纹图谱多成分、整体质量控制，选择白术对照药材作为随行对照，为与颗粒提取工艺保持基本一致，将白术对照药材进行水煎煮。结果对照药材与颗粒色谱峰基本一致，故选择白术对照药材作为麸炒白术配方颗粒指纹图谱的参照物。

经与对照品比对，在25.585 min的色谱峰为咖啡酸的色谱峰，在44.497 min的色谱峰为异绿原酸B的色谱峰，在45.128 min的色谱峰为异绿原酸A的色谱峰，在46.935 min的色谱峰为异绿原酸C色谱峰，其中峰9响应稳定，达到基线分离，故选择峰9作为对照品参照峰，并将其标记为峰S。

本文采用HPLC建立了麸炒白术配方颗粒指纹图谱，对其相似度进行评估，采用UPLC-Q-TOF-MS分析技术指认了8个共有峰，分别为对羟基苯甲酸、咖啡酸、东莨菪内酯、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、刺五加酮、洋蓟素，可为麸炒白术配方颗粒的大批量生产质量标准建立及全过程质量监控提供参考。