肠道微生态在代谢相关脂肪性肝病发病与治疗中的研究进展

张雅慧 李国强 林 毅 丁晓颖 彭永德

随着肥胖和代谢综合征的全球性流行，代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)已经成为世界第一大肝脏疾病。MAFLD是以肝细胞脂肪过量堆积为病理特征的慢性肝病，其进一步发展不仅会导致肝脏炎症、纤维化和恶性肿瘤发生，而且常合并多种代谢紊乱，引起痛风、2型糖尿病(T2DM)、高血压、动脉粥样硬化等严重疾病的发生。MAFLD的诊断标准是基于肝脏脂肪堆积的组织学、影像学和血液生物标志物证据，同时合并以下3项条件之一：超重、T2DM、代谢功能障碍。MAFLD是由遗传因素与环境因素相互作用引起的复杂疾病。MAFLD患者的死亡率逐年升高，其大多数死亡是由心血管事件引起的。目前尚无被批准直接用于治疗MAFLD的药物。因此，迫切需要新的治疗策略来减少或逆转 MAFLD的发生和发展。

近期的研究结果表明，肠道微生物在MAFLD的发生和发展中起到一定的作用。肠道菌群菌株的组成和分布受多种因素，如年龄、健康或疾病状态、肠腔的环境pH值、营养状态和益生菌[1]等影响。微生物群与超重、亚临床炎症和胰岛素抵抗之间密切相关。代谢物谱分析为包括MAFLD在内的疾病的分子机制提供了新见解。已有研究[2]确定了与MAFLD疾病不同阶段相关的特定代谢组学特征。MAFLD的严重程度与肠道菌群失调和肠道菌群代谢功能的改变有关[3]。此外，近年来出现的肠道、肝脏和血液代谢物之间相互作用的证据表明，肠-肝轴是MAFLD发生和发展的重要组成部分。以肠道微生物为靶标来治疗MAFLD及相关疾病将成为未来研究的热点。使用来自粪便和(或)血液样本的肠道微生物相关生物标志物是目前研究中可用的非侵入性检测方案。以下对肠道微生态与MAFLD之间关系的研究进展进行综述。

1 MAFLD命名的历史沿革

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关，以肝细胞大泡性脂肪变为病理特征的慢性代谢应激性肝脏疾病。疾病谱主要包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic fatty hepatitis,NASH)及其相关的肝硬化和肝细胞癌。鉴于绝大多数NAFLD患者具有肥胖症、T2DM、代谢综合征累及肝脏的病理学表现，对于描述与代谢功能障碍相关的肝脏疾病，MAFLD可能是更合适的疾病名称。因此，2020年国际专家小组经过讨论，一致决定将NAFLD更名为MAFLD。肠道菌群受生活方式的影响极大，因此，肠道菌群与MAFLD之间的关联逐渐成为研究热点和治疗MAFLD的潜在干预目标[4]。

2 肠道微生态与MAFLD发病机制的相关性

传统观念认为，NASH的发病机制可由Day和James[5]在1998年提出的 “双重打击”假说阐述。具体来说，胰岛素抵抗是第一个刺激(第一重“打击”)，引发脂肪在肝细胞累积，导致肝脏脂肪变性。第二重“打击”是氧化应激，促进肝脏发生组织损伤、炎症和纤维化。脂肪变性增加了肝脏对第二重“打击”的敏感性。随着研究的不断深入，“双重打击”假说不足以解释这种异质性疾病的发病机制，特别是在非肥胖人群中。游离脂肪酸在肝脏中的累积主要以TG的形式存在。动物实验结果表明，TG本身没有肝毒性，但当肝细胞暴露于TG代谢物(如游离脂肪酸、二酰甘油、胆固醇、神经酰胺、磷脂等)可导致炎症和纤维化发生。因此，TG合成似乎是一种适应性的有益反应[6]。在这个意义上，Tilg等[7]提出了一个新的理论——“多重平行打击”假说：几个同时的而不是连续的刺激诱导氧化应激，从而导致肝脏脂肪变性和脂肪性肝炎发生。与“双重打击”假说相反，“多重平行打击”假说认为MAFLD的炎症可能先于肝脂肪变性发生。在这种假说解释中，MAFLD的发病不仅来自氧化应激，也来自不同“打击”之间的相互作用，包括脂质代谢改变、线粒体功能障碍、内质网应激、遗传易感性和肠道微生物群改变。肠道微生物群参与MAFLD的发病及其进展已被越来越多的研究者认同。

2.1 肠道微生态与氧化应激和炎症反应 在肠道微生态的各种功能中，目前被关注最多的是氧化应激的调节。众所周知，生理性的NO过度合成会加重氧化应激和炎症反应，而胃肠道中含有丰富的NO来源，如肠道组织(即肥大细胞、平滑肌和神经丛)、白细胞和共生厌氧菌。肠道乳酸菌和双歧杆菌能够将硝酸盐和亚硝酸盐分解为NO，同时促进宿主上皮细胞释放NO。除了分解硝酸盐产生NO外，肠道链霉菌和杆菌还通过分解L-精氨酸产生NO。低浓度的NO可在凋亡中发挥神经保护功能，但过量的NO产生与细胞损伤、轴突变性、神经炎症和退行性疾病的发生有关，是有害的。NO的过度合成会导致活性氧的产生，如超氧阴离子和过氧化氢，过氧化氢形成高活性的羟基自由基，导致脂质过氧化和DNA损伤。线粒体是活性氧和氮氧化物产生的主要场所。有研究结果表明，肠道微生态代谢物，特别是短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA)，能够影响线粒体功能，减少活性氧的产生。还有研究结果表明，SCFA可以通过改变染色质结构、诱导抗氧化剂谷胱甘肽的产生和提高环氧合酶(COX)-2的活性来减少端粒缩短和DNA损伤发生。肠道微生态代谢物对机体来说是一把“双刃剑”，一方面共生菌对氧化应激起到有益的作用；另一方面，病原体(沙门菌和大肠埃希菌)能够降解含硫氨基酸，在肠道中产生硫化氢(H2S)。高水平的H2S对宿主产生负面影响，如抑制COX活性、将代谢转移到糖酵解从而导致乳酸增加和ATP产生减少。此外，研究结果表明，暴露于高水平的H2S会导致线粒体耗氧量降低，导致促炎因子(特别是IL-6)表达增多。肠道微生态及其代谢物在机体的炎症及免疫功能方面发挥着重要的作用[8]。因此，维持一个健康绿色的肠道微生态是人体健康的基础。

2.2 肠道微生态与饮食 多种因素的结合，包括遗传和环境特征(分娩类型、抗生素治疗、饮食组成、生活方式、社会互动和接触各种异种生物)塑造了肠道微生物群，使每个个体有其独特的肠道微生物组成[9]。饮食是驱动肠道菌群组成和代谢的主要因素，一项研究[10]结果表明，在3 d内日均能量摄入增加2 400～3 400 cal(10～15 kJ,营养成分比例类似24%蛋白质、16%脂肪和60%碳水化合物)会增加厚壁杆菌门的丰度，降低拟杆菌门的丰度。

高脂饮食和高糖饮食以不同的方式改变肠道菌群的结构。高脂饮食会降低肠道微生物的丰富度与多样性，改变肠道菌群的组成和结构，具体表现为拟杆菌数量减少，厚壁菌和变形菌数量增加[11]。菌群变化不仅会通过摄取更多的能量导致肥胖，而且会造成肠道通透性增高、脂多糖(LPS)的转移和全身慢性炎症，不利于人体健康。已有研究结果表明，高糖饮食的小鼠肠道菌群发生变化，表现为厚壁菌和拟杆菌数量减少。高果糖摄入会上调脂肪的从头合成，抑制脂肪酸β氧化，导致肝脏发生脂肪变性和启动炎症反应，最终形成 MAFLD。

限制能量的饮食模式丰富了与益生菌作用相关的菌群，减少了与炎症和肥胖相关的菌群。在肥胖受试者中，能量摄入的减少使厚壁菌门数量减少，拟杆菌门数量增加[12]。此外，这种限制能量的饮食增加了肥胖受试者的微生物基因丰富度，并使体内LPS水平趋于正常。

2.3 肠道微生态与脂质代谢 肠道微生态调节宿主体内的多种代谢过程，包括能量平衡、葡萄糖代谢和脂质代谢。脂质代谢包括脂肪酸、TG和胆固醇等脂质的生物合成和降解。饮食组成对肠道微生物的代谢输出至关重要，其原因为肠道微生物将营养物质加工成代谢物，以及饮食影响肠道微生物组成，从而影响肠道微生物的代谢潜力和对宿主的影响。膳食纤维对肠道微生物的组成和功能的重要性已被广泛研究。与常规喂养的小鼠相比，无菌小鼠通过增加脂肪酸氧化和减少脂肪细胞中TG沉积等多种机制，对饮食诱导的肥胖具有保护作用。在高脂高胆固醇饮食饲喂的小鼠中，弯曲乳杆菌单独或与植物乳杆菌联合使用可降低血浆和肝脏中的胆固醇水平。同样，在高脂饮食的肥胖小鼠中，双歧杆菌属肠道细菌使血清TG和低密度脂蛋白水平降低，高密度脂蛋白水平升高[13]。总体而言，对动物模型的研究结果表明，肠道微生物与饮食相协调，调节宿主的脂质代谢，以及血清和组织中的脂质水平。

3 MAFLD患者肠道微生态的改变

3.1 肠道微生物 肠道微生物群丰富度和多样性的变化将其与MAFLD的发展联系起来，MAFLD的每个阶段都有特殊的肠道菌群特征[14]。Behary等[15]的研究通过鸟枪法(shotgun)宏基因组测序阐明了MAFLD-肝硬化及MAFLD相关肝细胞癌患者肠道微生物宏基因组学特征：①在门水平上，MAFLD相关肝细胞癌患者肠道中变形杆菌比非MAFLD对照组增加，但与MAFLD-肝硬化相比则无差异。②在科水平上，MAFLA相关肝细胞癌患者肠道中肠杆菌科比MAFLD-肝硬化(P=0.033)和非MAFLD对照组(P=0.025)增加。MAFLD-肝硬化与MAFLD相关肝细胞癌患者肠道中颤螺旋菌科比非MAFLD对照组减少(P=0.038)。MAFLD-肝硬化组患者肠道中真菌比MAFLD相关肝细胞癌(P=0.013)和非MAFLD对照组(P=0.000 2)增加。MAFLD-肝硬化患者肠道中棒状杆菌比非MAFLD对照组增加 (P=0.034)，几种拟杆菌减少，但与MAFLD相关肝细胞癌患者的差异无统计学意义(P>0.05)。③在种水平上，对微生物组的检查发现，与非MAFLD对照组组相比，在MAFLD相关肝细胞癌和MAFLD-肝硬化患者中显著富集了一组常见细菌物种，包括解木聚糖拟杆菌(P=0.008)、瘤胃球菌(P<0.001)和梭状芽孢杆菌(P<0.001)。

肠道微生态参与MAFLD可能的机制包括肠道内细菌作用于碳水化合物、胆汁酸、胆碱等营养物质产生的代谢产物，如SCFA、次级胆汁酸、三甲胺(trimethylamine，TMA)等对代谢的调节；肠道内细菌成分的改变使肠道通透性增加，过多LPS进入血循环,导致机体局部和系统的慢性炎症等发生[16]。

3.2 肠道代谢产物 肠道内的营养物质在细菌的作用下产生多种代谢产物，最常见的有SCFA、支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)、次级胆汁酸、TMA等，这些代谢物的变化在肝损伤的病理生理中起作用。重要的是，所有这些代谢产物被证明与肥胖和代谢改变有关，包括T2DM。动物实验结果表明，在肥胖期间LPS增加，会促进组织中胰岛素抵抗途径的激活[17]。虽然SCFA有益于新陈代谢，但其参与能量生成，可能会导致体重增加[18]。研究发现，与健康人群相比，肥胖人群粪便样本中的SCFA水平升高。总体而言，肠道代谢产物在MAFLD生理病理中的具体作用是复杂的。

3.2.1 胆碱、甜菜碱和循环甲胺 饲喂胆碱缺乏饮食的小鼠被认为是MAFLD的代表模型，减少胆碱摄入会导致肝脏脂肪增加和肠道细菌改变[19]。给予健康女性胆碱缺乏饮食后，粪便内中厚壁菌和变形杆菌的比例发生变化，这与肝脏脂肪的变化直接相关[19]。胆碱可直接通过肠道菌群或通过甜菜碱转化为TMA，TMA可被肝脏中的黄素单加氧酶3氧化为三甲胺N-氧化物(trimethylamineNoxide，TMAO)。在MAFLD致病机制中，胆碱向TMA和(或)TMAO的转化增加，导致胆碱缺乏、TMA和(或)TMAO的积累[20]。胆碱可促进极低密度脂蛋白(VLDL)从肝脏转运，胆碱缺乏可导致脂质在肝脏中累积[21]。动物研究结果表明，MAFLD的严重程度与尿液中TMA和TMAO水平升高有关。

3.2.2 TMAO和胆汁酸 胆汁酸由胆固醇在肝脏中经过一系列酶促反应生成初级胆汁酸，大部分初级胆汁酸通过肝肠循环回到肝脏，小部分在肠道内细菌的作用下转化为次级胆汁酸[22]。胆汁酸被认为是全身能量稳态的代谢整合因子，参与各种代谢途径的调节，包括自身合成和肠-肝循环、TG、葡萄糖和能量稳态等。初级和次级胆汁酸具有内分泌功能，通过不同的受体调节多种宿主代谢途径[22]。胆汁酸的调控作用由特异性胆汁酸激活受体介导，包括法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)和G蛋白偶联受体的成员，主要是G蛋白胆汁酸偶联受体5(TGR5)[23]。在小肠中，FXR诱导肠道激素——成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)的分泌，通过与肝脏表达的FGF受体4 (FGFR4)结合抑制肝脏胆汁酸的合成。FXR通路的激活不仅调控胆汁酸的合成和肠-肝循环，还可以控制肝脏脂肪的从头生成、VLDL输出TG和糖异生[24]。TGR5广泛分布于肠道、肝脏等多种组织中。次级胆汁酸激活TGR5可诱导肠道L细胞释放胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide,GLP-1)，从而引起GLP-1依赖的糖耐量和肝功能改善[25]。胆酸池大小和成分与代谢性疾病有关。肠道微生态失调可能会影响胆酸池的组成和动态平衡。来自小鼠和人类的实验证据表明，肠道微生物群对胆汁酸的生物转化(去结合、脱氢和脱羟基)与MAFLD的进展有关[26]。胆汁酸的减少与TMAO的产生有关， TMAO抑制了参与胆汁酸代谢的关键酶——胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)，从而导致总胆酸池减少。晚期肝硬化患者的胆汁酸转化率降低，并伴随着微生物组成的改变，包括肠杆菌的丰度增加，毛螺菌科、瘤胃球菌科的丰度减少[27]。

3.2.3 SCFA SCFA是肠道有益细菌代谢膳食纤维等碳水化合物所产生的代谢物，其中乙酸、丙酸和丁酸含量最丰富，占总SCFA的95%以上[16]。微生物产生的SCFA主要通过在结肠中的扩散或共转运被吸收，而其内部信号转导作用是通过激活G蛋白偶联受体41和G蛋白偶联受体43来介导的[28]。SCFA参与脂肪酸合成和糖异生，故被认为是升高肝脏TG水平，促进能量储存和体重增加的重要底物[29]。研究人员将MAFLD患者和健康人群进行比较，观察到MAFLD患者粪便中SCFA水平增高；同时，参与其产生的细菌群也增加[30]。此外，MAFLD患者的粪便SCFA和微生物特征的增加与外周血中静息调节性T细胞(CD4+CD45RA+CD25+Treg)数量减少和辅助T17(Th17)细胞水平升高有关。然而，SCFA的作用相当复杂，其也会对代谢产生益处。丁酸盐可减少肠道的局部炎症的发生，并可防止炎症反应对全身循环产生不利影响。丁酸酯可以激活肠道中的调节性T细胞，抑制Th17细胞，从而抑制促炎症信号通路。此外，丁酸酯可通过调节线粒体功能，促进产热，并进一步通过肠-脑轴激活棕色脂肪组织来增加能量消耗[31]。

3.3 肠道微生态对肠黏膜机械、生物、化学、免疫屏障的影响 饮食、感染、药物、肠道病变等引起肠道菌群结构改变和肠道代谢产物的变化，会导致肠道通透性的增加，肠道微生物产物，如革兰阴性菌细胞壁的组成部分——LPS移位入血。宿主循环中LPS水平升高致内毒素血症，经Toll样受体介导，诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等多种促炎因子产生增多，引发外周组织低度炎症[32]。肠黏膜包含机械、生物、化学、免疫屏障，当肠道微生态失衡时，会导致这些屏障功能受损而致病。

肠黏膜机械屏障是由肠黏膜上皮间的紧密连接(tight junction,TJ)、上皮细胞及其分泌的黏液、表面的菌膜等构成的一道内毒素和细菌不能自由逾越的物理屏障。肠道菌群可通过刺激Toll样受体诱导肠上皮细胞增殖,加固肠黏膜上皮TJ,减少病原菌对肠黏膜的损害,维护肠道屏障功能。一旦肠道微生态失衡将导致小肠细菌过度生长,增殖的致病菌直接损伤肠上皮细胞TJ,使肠黏膜通透性增高引起细菌及其产物移位进入肠肝循环而致病[33]。

肠黏膜生物屏障是由肠道内自身菌群与肠道黏膜结合形成的一个相互依赖、相互制约的微生态平衡系统。厌氧菌能分解植物纤维产生丁酸,丁酸能够作为肠壁细胞的能量来源促进水分吸收,保证机体正常代谢。

肠黏膜化学屏障由消化道分泌的胃酸、溶菌酶、黏多糖、胰蛋白酶和胆盐等组成。胃肠道的微生物代谢产生的SCFA是肠上皮的主要能量来源,而胆盐有助于益生菌在肠道定植,促进黏膜生长和修复,诱导肠壁组织细胞增殖。

肠黏膜免疫屏障由肠黏膜分泌的IgA和肠相关淋巴组织等构成。肠道正常菌群通过占位效应、营养竞争，以及分泌各种代谢产物和细菌素等途径抑制条件致病菌的过度增殖,并刺激机体免疫系统发育、成熟。菌群失衡时致病菌分泌的肠毒素使肠黏膜通透性增高,其分泌的免疫抑制性蛋白可致黏膜免疫失调。

4 肠道微生态平衡对MAFLD影响

由于人类肠道微生态的可塑性，基于对肠道微生态参与MAFLD机制的研究，目前已开发了许多以肠道微生态为靶点的MAFLD的干预手段，主要从调节肠道菌群及其代谢产物入手，包括饮食、运动，以及益生菌、益生元的补充。

4.1 生活方式的改变 已知生活方式会影响肠道菌群的组成及丰度，包括饮食和运动。不同的营养物质和饮食模式均可引起肠道微生物组成结构及功能的变化，并可能通过对肠道微生态对人类生理和疾病过程产生重要影响[34]。

特定的饮食干预措施可通过调节肠-肝轴对MAFLD进行治疗，如地中海饮食可以改善宿主能量代谢和减轻体重。地中海饮食包括全谷物和单不饱和脂肪酸，全谷物中的纤维、多酚可以减少能量摄入，并增加肠道中的双歧杆菌、乳杆菌、梭菌属，增加肠道中丁酸含量,以改善MAFLD,减轻胰岛素抵抗，且丁酸具有抗炎作用[35]。

Carbajo-Pescador等的研究阐述了在活体模型中运动对肠道微生物组成和功能平衡的益处，以及由此对早期肥胖和MAFLD发病的影响。在这项研究中，研究者发现运动可以有效抵消高脂饮食诱导的微生物失衡，保护肠道屏障，改善了胆汁酸稳态，决定了MAFLD的临床转归。摄入高脂饮食增加了厚壁杆菌的相对丰度，降低了拟杆菌的丰度，导致高脂饮食喂养的大鼠厚壁杆菌/拟杆菌的比例较对照组明显增高；运动抵消了高脂饮食引起的微生物失衡，降低了厚壁杆菌的丰度，增加了拟杆菌的相对丰度，从而改变了厚壁杆菌/拟杆菌的比例。

4.2 益生菌、益生元 对肠道菌群组成的研究结果表明，其组成发生变化(例如，双歧杆菌数量减少)会导致血浆LPS水平升高，从而导致促炎症细胞因子水平升高，益生菌双歧杆菌可增强胰岛素的敏感性，减少肝脏中的脂肪累积[36]。目前已在MAFLD的动物模型中测试了多种益生菌的作用，试验结果均证明益生菌具有改善MAFLD的作用[37]，这为人类临床研究提供了理论基础。

已有多项研究使用多种细菌的组合来改善益生菌的功效。 VSL#3是一种由8个细菌菌株组成的益生菌制剂，已在临床前和临床上进行了研究，显示出其能抑制NF-κB表达,减轻肝炎和肝脏脂肪蓄积，提高胰岛素敏感性的能力[38]。

益生元是能促进肠道有益细菌生长的复杂的碳水化合物，如膳食纤维。益生元由肠道微生物发酵成SCFA、L-乳酸、二氧化碳、氢、甲烷等代谢物，以多种方式调节下游代谢过程[39]。益生元可改变肠道菌群的相对丰度(如厚壁杆菌减少和拟杆菌增加)和饱和肠肽的水平，减少全身炎症发生，改善糖耐量[40]。低聚果糖(FOS)和菊粉已在各种动物模型中被证明可以改善MAFLD。菊粉是一种特殊类型的果聚糖，其特征是含有多个β-2，1键，可由肠道细菌发酵产生丁酸。Weitkunat等[41]报道，给小鼠喂食菊粉可增加其肠内SCFA，减少脂肪生成和脂肪酸延伸合成。益生元对MAFLD的有益作用已在一些人类研究中得到证实。此外，最近的一项综述显示，使用FOS、菊粉的临床试验证实其可能不适用治疗MAFLD[42]。因此，需要进一步的研究来证明益生元对MAFLD的影响。

5 小结与展望

MAFLD是世界范围内肝脏疾病的主要病因之一，可导致肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌。目前，对这种异质性疾病发病机制的共识是基于多重打击学说，根据该理论，炎症是MAFLD进展为纤维化的首要原因。目前对MAFLD最有效的治疗方法是控制体重，形成一个健康的生活方式，减少代谢相关危险因素，但尚无确切的药物治疗方法。肠道微生物或其产物被认为在MAFLD的病因和进展中起着重要作用。有研究结果表明，将常规饮食小鼠粪菌移植至高脂高糖饮食小鼠肠道可显著减少高脂高糖饮食小鼠的肝脏TG含量，延缓肝脏组织学进展。此外，粪菌移植还可以部分纠正高脂高糖小鼠的肠道菌群失调，增高粪便中丁酸盐的水平。但目前仍缺少关于粪菌移植对人类代谢综合征、MAFLD作用的研究。多项证据表明，LPS是肠道微生物代谢和促炎效应的重要中介。MAFLD的不同阶段具有与肠道菌群相关的不同特征。肠道微生物群的多样性改变是由多种细菌代谢产物介导的，包括胆汁酸、丁酸、胆碱、SCFA。未来肠道菌群可能作为一种生物标志物，为临床研究MAFLD的发病机制提供新方向。通过治疗将“促进疾病”的肠道菌群组转变为“抵抗MAFLD”的肠道菌群组是一个阻止或逆转MAFLD进展过程的有吸引力的策略。调节肠道菌群的药物如益生菌、益生元和某些细菌代谢物的补充具有治疗益处，这已在MAFLD的动物模型中得到证明，但在当前，其临床研究尚处于初期阶段，或能为临床治疗带来新的曙光。