PCR实验室的污染及其防范措施

陈 永，杨莲辞，常定发

（1.云南省泸西县动物疫病预防控制中心，云南 泸西 652400；2.云南省泸西县动物卫生监督所，云南 泸西）

随着动物疫病检测需求增加，PCR基因扩增实验室业务量有所加大。开展PCR检测，很可能会出现实验室污染，影响实验质量和效果，造成假阳性，同时也会给实验人员健康造成损害。

1 PCR实验室污染检测评估

（1）因PCR检测的样品及其产物污染无色无味，主观很难判断，应定期对实验室操作台、地板、设备、器具等采集棉拭子样进行检测，评估是否存在污染。样品要规范编号记录，以便追溯。（2）查看实验室最近疑似污染实验检测报告，看阴性对照（水）Ct值（反应管内营光信号达到设定的值时所经过的循环数）。阴性对照（水）Ct＞38，轻微污染；35＜Ct＜38，中等污染；Ct＜35，严重污染。如只是阴性对照污染，样品中仍有阴性，则可能是样品交叉污染或操作不当，通过规范仔细的重复操作以避免污染。如所有的曲线都呈阳性，而且阴性对照和许多标本的线性相似，则考虑是系统污染，如检测试剂污染或气溶胶污染。（3）试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

2 污染的来源

2.1 阳性样本或阳性样本核酸的污染 此类污染多发生于样品处理间，造成样品间的污染。在采集的样品中，如存在阳性样品，在样品的采集、放置、运输的过程中，由于封装不严溢出于容器外，导致污染容器、样品的交叉污染等；实验过程中，移液器使用不当，吸液时回枪手速过快导致的移液器枪头部分被阳性样本污染；样品加热裂解核酸后，立即打开仪器热盖，反应管突然遇冷导致崩开，溅出核酸；核酸释放后，未离心，管盖上有液体，溅出导致的污染；吸取阳性对照的枪头，处理不当造成的污染；由于通风不良，病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致交叉污染。

2.2 阳性对照的污染 在使用阳性对照时，未离心，导致阳性对照泄漏，造成的污染；吸取阳性对照的枪头，处理不当造成的污染。阳性对照的泄露易造成试剂的污染。

2.3 PCR扩增产物污染 扩增过程中或扩增结束后，PCR管盖未盖严或崩开导致扩增产物泄露，造成的污染。因为PCR产物拷贝量大，扩增后的PCR管开盖等动作容易产生气溶胶，极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。

3 防范污染的措施

进行PCR检测操作时，操作人员应该严格遵守操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR检测过程中的污染。

3.1 划分操作区 实验操作在三个不同的区域内进行，试剂配制、样品处理和扩增要在不同的隔离区内进行：（1）试剂准备间：配置试剂、加阴性对照，要有单独的一套移液枪、离心机、耗材，试剂配制应在独立的生物安全柜内进行。该区域不做任何跟样本相关的操作，严禁跟样本相关的任何物品进入。（2）样本处理间：样本处理、核酸提取、加样本核酸、阳性对照等。要有单独的一套移液枪、离心机、耗材等。样本提取应在独立的生物安全柜内进行。该区域主要处理样品，严禁带未消毒的设备进入样本处理间。（3）PCR扩增区及分析间：放置PCR仪、电脑及打印机等设备。任何一间的器材独立使用，不要拿到其他两个工作间。

3.2 实验人员操作规范 （1）操作前佩戴好个人防护用品，用核酸祛除剂喷洒移液器、吸头盒等，并放入生物安全柜中。（2）实验人员操作时要穿戴各区间的专用工作服、手套、口罩等，完成一项操作或发现污染及时更换手套。实验完成离开实验室，更换工作服，脱掉手套、口罩等，严禁将工作服穿出实验室外。（3）对一些活毒样品在提取前，应将样品用60 ℃ 水浴灭活处理不少于30 min，防止活病毒造成污染和扩散。（4）吸头盒不用时保持关闭状态，避免吸完样品，特别是阳性对照的吸头经过时造成污染。（5）取样、加液前，应做瞬时离心，将管盖、管壁上液体完全沉于管底。开盖时动作要轻缓，防止液体溅出。使用移液器时要注意快压慢放或使用带滤芯的吸头，防止液体污染移液器管头。（6）实验过程中最先加阴性对照，盖好盖子后再加待检核酸，最后加阳性对照。用后的废吸头、其它废弃物品、污染物等集中放入装有10 % 84消毒液的废液缸内，消毒液要能完全浸泡废弃物品。（7）PCR扩增完成后，如无必要，尽量不要打开或少打开反应体系，如必须打开，应在独立专用区域内进行。

4 污染的处理

4.1 轻度污染的处理 PCR板、八联管板、离心机转子用50 % 84消毒液浸泡30 min，反复几次。操作台面先酒精擦拭，再用30 % 84消毒液反复擦拭几次，每次实验前后都要用酒精对所有的操作台面、移液枪、离心机进行擦拭。地面用30 % 84消毒水进行擦拭，1～2次/d。实验环境通风、紫外线灯照射。经过以上方法处理，污染基本可以1周左右消除。

4.2 中度和重度污染的处理 （1）评估污染源头：评估是环境污染、器材污染（尤其是移液枪和离心机）还是试剂盒污染。①准备一套新的移液枪、离心机、耗材、试剂盒。②用新的移液枪和原来试剂在新的环境配2个阴性对照上机扩增，如果没有污染，说明试剂盒没有问题；如果有污染，说明试剂盒有污染。用新的移液枪和新的试剂盒在原来环境配2个阴性对照上机扩增，如果没有污染，说明环境没有问题；如果有污染，说明环境有污染。用原来移液枪和新的试剂盒在新的环境配2个阴性对照上机扩增，如果没有污染，说明移液枪没有问题；如果有污染，说明移液枪有污染。（2）不同污染的处理：①器材污染：移液器污染移液枪不带枪头吸酒精，并把枪柄部分浸泡在酒精中，目的是使有机物溶解。再用移液枪不带枪头吸清水，反复几次，目的是把酒精及有机物清洗掉，之后用移液枪不带枪头吸50 % 84消毒水，反复几次，并停留30 min，最后用移液枪不带枪头吸清水，反复几次，目的是把84消毒水清洗掉。以上操作重复几次，再用三把移液器不带枪头吸清水，把清水当作样品进行检测，评估污染是否消除。离心板架或者八联管板架污染，使用酒精浸泡后，再用清水清洗干净，之后再用30 % 84消毒水浸泡30 min以上，最后再用清水清洗干净，多重复几次。离心机污染，使用酒精擦拭后，用清水反复擦拭，转子用50 % 的84消毒液浸泡，再用清水洗干净，晾晒干，再用棉签取离心机拭子检测，评估污染是否解除。②试剂盒污染，封存，用新的试剂盒实验。③环境污染，30 % 84消毒液擦拭操作台面2～3次，次数可根据实际情况增减。设备门把手、门窗把手和外部区域10 % 84消毒液擦拭2～3次。所有垃圾能用消毒水浸泡的浸泡，不能浸泡的无害化处理。地面采用拖把沾50 % 84消毒液进行反复拖地，1～2次/d。有紫外线的设备开启紫外线灯照射30 min，房间内进行紫外线长时间照射消毒，每天进行 。环境保持通风，降低气溶胶的蓄积，如果通风不畅的可采取风扇机械通风。处理后采集环境样品进行检测，评估污染是否消除。