青春期慢性社交挫败应激致小鼠认知功能障碍及内侧前额叶皮质髓鞘损伤

徐颖娟，方泽漫，吴彩茹，黄庆军，张瀚迪

(汕头大学精神卫生中心，广东 汕头 515065)

社交挫败应激动物模型广泛应用于抑郁症等应激相关精神疾病的研究[1]。既往研究显示青春期或成年期社交挫败小鼠前额叶皮层髓鞘含量减少[2-3]，动物表现出社交回避及抑郁样行为[4]。青春期及成年期NG2细胞不断分化成熟，参与髓鞘的稳态维持。这一过程也受到外界环境因素影响，目前认为这可能是神经可塑性的生物学基础之一[5-6]。青春期小鼠经历社交剥夺后表现为工作记忆损害、社交退缩，这些行为改变与前额叶髓鞘及少突胶质细胞损伤相关[5]。这些研究提示青春期应激经历可能导致前额叶白质损伤及认知功能障碍。然而，青春期社交挫败应激对少突胶质细胞系细胞和髓鞘的发育，以及认知功能的影响尚未深入探讨。本研究探讨青春期社交挫败应激对小鼠执行功能、记忆以及少突胶质细胞系/髓鞘相关病理的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 21日龄青春期雄性BALB/c小鼠34只，8～9月龄CD-1(ICR)小鼠，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物合格证编号分别为 11400700178467 及 11400700178659)。BALB/c小鼠每笼4只饲养，CD-1小鼠单笼饲养，提供充足食物和水，实验前适应环境3 d。饲养房室温保持在(23±2)℃，湿度维持在(50±5)%，保持12 h光照和12 h黑暗交替，动物自由进食、饮水。本研究通过汕头大学动物伦理委员会审批(伦理号SUMC2016-117)。

1.1.2 主要试剂与仪器 髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)购自美国Santa cruz公司，β-actin抗体购自中国新晋生物公司，BrdU抗体、NG2抗体、腺瘤性结肠息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)抗体购自美国Chemicon公司、离子化钙离子结合接头分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)抗体购自日本Wako公司，皮质酮酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自瑞士Enzo Life Sciences公司。

1.2 方法

1.2.1 实验流程 BALB/c小鼠随机分为对照组和应激组，每组17只。应激组在产后第25～42天接受慢性间歇性社交挫败应激，应激期间每3 d应激后停止1 d，对照组不接受任何应激。应激结束后第1～3天进行迷盒实验，于第4～5天麻醉后取血，脑组织用于ELISA、Western blot及免疫组化检测。应激结束后第1～4天下午16:30～18:00腹腔注射BrdU，剂量为100 mg/kg。

1.2.2 社交挫败应激 将BALB/c实验鼠置于CD-1小鼠笼中，接受躯体攻击2 min，然后将BALB/c小鼠置于笼中与CD-1小鼠在躯体上隔离，但实验鼠仍能感受到CD-1攻击鼠的气味、目光和声音，该过程持续30 min，最后将BALB/c实验鼠移回原笼内。

1.2.3 迷盒实验 该实验用于检测啮齿类动物的认知功能，实验方法参考Ben等[7]的报道。迷盒主要由明区及暗区(目标区)组成，利用啮齿类动物趋暗天性，在明区进入暗区的通道中设置不同的障碍，改变进入暗区的难易程度，通过检测小鼠从实验开始到首次进入暗区的时间(潜伏期)评估它的执行功能、短期记忆及长期记忆。实验分3 d，3个测试/d，共进行9个测试，记为第1天(T1、T2、T3)；第 2天(T4、T5、T6)；第 3天(T7、T8、T9)。迷盒实验条件设置见表1。每组10只小鼠，将小鼠置于明区远离门的一端，让其自由活动，记录其进入暗区所用的时间。如果超过5 min仍未进入暗区，则记录时间为300 s。

表1 迷盒实验条件设置

1.2.4 免疫组化 麻醉取脑后用多聚甲醛固定，蔗糖溶液脱水用于冰冻切片。切片加入NG2抗体(1∶200稀释)，Iba1抗体(1∶1 000稀释)，APC抗体(1∶200稀释)，4℃孵育过夜，生物素化二抗室温下孵育1 h，加入ABC混合液，磷酸盐缓冲液清洗后二氨基联苯胺显色，酒精脱水及二甲苯透明封片保存，显微镜下观察。BrdU免疫组化检测步骤：加入BrdU抗体，4℃孵育过夜，生物素化二抗室温下孵育1 h，加二抗，封片固定，镜下200倍分析。每只鼠在内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex，mPFC)区 (bregma+1.98 mm～+1.54 mm)间隔150 μm取3张脑切片做定量分析，结果以细胞数量/mm2表示。

1.2.5 Western blot 脑组织在RIPA裂解液中匀浆后离心10 min(13 400×g，4℃)取上清液。按BCA试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白样品经电泳分离后，电转至PVDF膜。室温孵育1.5 h后加入相应一抗山羊抗MBP(1∶1 000稀释)，鼠抗β-actin(1∶5 000稀释)孵育过夜，然后分别加入相应二抗，室温孵育1 h，ECL化学发光显影定影。

1.2.6 ELISA 小鼠经异氟烷吸入麻醉至浅反射消失后，快速内眦取血，室温静置1 h，800×g，4℃离心10 min后按照ELISA试剂盒检测说明书进行检测。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件进行分析，正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较用独立样本t检验；偏态分布的2组间比较采用Mann-WhitneyU检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青春期慢性社交挫败应激损害小鼠短时记忆及长时记忆

在迷盒实验的T3及T4测试，应激组首次进入目标区的潜伏期比对照组延长，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而在其他测试中，2组差异没有统计学意义(均P＞0.05)。见表2。

表2 应激组与对照组首次进入目标区的潜伏期比较 (s)

2.2 青春期慢性社交挫败应激降低mPFC脑区MBP的表达

在mPFC脑区，应激组小鼠MBP蛋白的表达较对照组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。应激组小鼠海马区MBP蛋白的表达差异没有统计学意义(P＞0.05)。见图1。

图1 应激组与对照组MBP表达比较

2.3 青春期慢性社交挫败应激不改变mPFC脑区少突胶质细胞系细胞及增殖细胞数量

应激组小鼠mPFC脑区OPC细胞(NG2阳性)、OL细胞(APC阳性)以及BrdU阳性细胞数量与对照组比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图2 应激组与对照组少突胶质细胞系细胞及增殖细胞数量比较

2.4 青春期慢性社交挫败应激不影响mPFC脑区小胶质细胞数量

mPFC脑区小胶质细胞(Iba1阳性细胞)胞体较小，突起呈高度分枝状，细胞均匀散在分布，应激组小鼠小胶质细胞数量与对照组比较差异没有统计学意义(P＞0.05)。见图3。

图3 应激组与对照组小胶质细胞形态与数量比较

2.5 青春期慢性社交挫败应激对应激相关生理指标的影响

应激组小鼠应激前体重和对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。应激结束后，应激组小鼠体重低于对照组，肾上腺质量高于对照组，差异均具有统计学意义(均P＜0.001)。而应激组和对照组小鼠外周血皮质酮含量差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 应激组与对照组应激相关生理指标比较 (n=17，±s)

表3 应激组与对照组应激相关生理指标比较 (n=17，±s)

组别对照组应激组t值P值应激前体重/g 13.61±0.62 12.73±1.49 1.452 0.185应激后体重/g 22.90±0.45 17.56±1.15 11.414＜0.001肾上腺质量/mg 5.29±1.60 9.29±1.50-4.86＜0.001皮质酮含量/(μg/mL)12.34±3.95 17.38±9.97-1.033 0.345

3 讨论

本研究显示青春期小鼠在社交挫败应激后，mPFC脑区MBP表达下降，而在海马区没有改变，提示社交挫败应激降低前额叶MBP表达。既往研究发现青春期经历慢性社会隔离应激的小鼠其前额叶MBP、髓鞘相关糖蛋白mRNA水平降低，髓鞘厚度变薄[5]，成年期慢性不可预见应激[8-9]或社交挫败应激[10]降低前额叶皮层髓鞘相关基因转录及表达。这些结果与本研究发现一致，表明不同类型的慢性应激均对前额叶髓鞘造成损害。Andersen等[11]临床研究发现14～16岁青少年遭受性虐到后前额叶皮层灰质减少，而海马则几乎没有改变。这与本研究结果类似，表明青春期慢性应激对前额叶髓鞘有特异性损害。

本研究发现慢性青春期社交挫败应激导致小鼠T3、T4测试时进入靶区域的潜伏期延长，显示存在短时及长时记忆损害。记忆功能受到海马、mPFC等多个脑区调控，任何一个相关脑区损伤都可能导致记忆障碍，而本研究中mPFC区髓鞘损伤，海马髓鞘没有损伤，表明前额叶髓鞘损伤可能和记忆受损存在相关性。但尚需进一步的干预研究探讨两者间的因果关系。

本研究发现前额叶MBP蛋白水平降低，OPC及OL数量无改变，BrdU细胞数量无改变。提示髓鞘MBP的降低不是由于OPC增殖及分化异常引起的。既往一些研究观察了社交挫败应激对OPC及OL的影响，但研究结果并不一致。青春期社交隔离小鼠出现mPFC脑区MBP表达下降，但少突胶质细胞数量没有变化，这与少突胶质细胞组蛋白乙酰化和常染色质增加有关[12]。临床证据表明幼年逆境不影响少突胶质细胞的增殖，但减少了扣带回皮层白质中的成熟少突胶质细胞数量，这与少突胶质细胞DNA甲基化降低有关[13]。以上说明髓鞘损伤可能通过表观遗传学调控。但目前应激对海马的髓鞘机制研究还较缺乏。

本研究发现青春期社交挫败应激不影响前额叶小胶质细胞数量及形态。但尚不能排除小胶质细胞参与应激所致的髓鞘损伤过程的可能。本研究采用Iba1检测小胶质细胞的激活状态，尚需采用其他激活状态标志物进一步地探讨。应激结束后第4天测量外周血皮质酮水平，应激组和对照组差异无统计学意义，表明青春期慢性应激不改变皮质酮基础水平。肾上腺在慢性应激条件下分泌糖皮质激素，在体外研究中发现糖皮质激素可导致髓鞘长度变短及MBP减少[14]，在体内研究中发现糖皮质激素对髓鞘形成有促进[15]或抑制[16]作用，同时高剂量糖皮质激素可降低髓鞘MBP的表达，而低剂量未抑制髓鞘MBP的表达[17]，这可能与髓鞘所处环境及糖皮质激素剂量不同有关，因此糖皮质激素高剂量毒性作用可能是mPFC脑区MBP表达降低的分子机制，我们计划在未来的研究中探讨这一可能性。

综上所述，青春期慢性心理应激导致认知功能损害及前额叶脑区髓鞘损伤，髓鞘损伤可能是认知功能下降的生物学机制。应激所致的髓鞘损伤可能涉及下丘脑—垂体—肾上腺轴激活及小胶质细胞介导的炎症反应，其具体机制尚需进一步研究。