柠檬绿茶酒抗氧化性研究

王 芳，李 维，陈麒麟

（四川旅游学院，四川 成都 610100）

茶叶是我国的传统饮品，是由茶树幼嫩的叶子制成的一种饮品，具有很多药用价值。茶叶中富含生物活性物质[1]，如茶多酚、黄酮类、咖啡碱等成分[2]，有助于提高人体免疫力、降低胆固醇、抑制心血管疾病、预防和抗癌等功效[3]。

柠檬富含维C、维B1、维B2，以及糖类、钙、磷、铁、烟酸、柠檬酸、苹果酸等营养物质[4]，具有丰富的活性物质与药用价值[5]，如具有杀菌、美容、降低胆固醇、预防坏血病、防止肾结石和心血管动脉硬化等功效[6]。

茶酒是指以茶叶为主料，通过发酵或配制等工艺生产的饮用酒[7]，既保留了传统白酒的风格，又具有茶香[8]，富含茶多酚、咖啡碱和氨基酸等成分[9]，在防治心血管疾病、抗氧化、抗癌变等方面都有很好的效果[10]。

在柠檬绿茶酒最佳酿造工艺条件的基础上，研究柠檬绿茶酒的抗氧化能力，为进一步开发茶酒提供理论依据，为茶酒的保健功能研究提供基础数据和理论参考。四川茶叶资源非常丰富，种植面积广泛，利用廉价茶叶开发茶酒成本低廉，可提高低端茶叶的加工利用率，增加茶农的收益。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

柠檬，资阳市安岳县提供；茶叶，雅安市春果茶叶有限公司提供；白砂糖，云南滇鹏糖业有限公司提供；果胶酶EX，法国波尔多市提供（BP17-33072）；葡萄酒果酒专用酵母SY，安琪酵母股份有限公司提供；碳酸氢钠（食品级）；硫酸亚铁、酒石酸甲钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、Tris、盐酸、邻苯三酚、DPPH、无水甲醇、无水乙醇，均为分析纯，成都金山化学试剂有限公司提供。

HH-4 型恒温水浴锅，常州国华电器有限公司产品；JYZ-E98 型榨汁机，九阳股份有限公司产品；Scout SE 型电子天平，常州奥豪斯仪器有限公司产品；101－0A 型电热鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司产品； UV1600 型紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海） 有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 柠檬绿茶酒加工工艺流程

①绿茶→洗涤→浸提→过滤→冷却→绿茶汁；

②柠檬→去皮→榨汁→酶解→脱苦→柠檬汁；

①+②调整成分→接种→发酵→澄清→灭菌→成品。

1.2.2 柠檬绿茶酒的制备

以柠檬和绿茶为原料，分别制备柠檬汁和绿茶汁。称取茶叶，按照茶水比1∶50（g∶mL） 的比例添加热水，浸提温度90 ℃， 浸提时间30 min，然后滤出茶渣，所得浸提液即为茶汁。取新鲜柠檬，使用适量碳酸氢钠进行清洗、揉搓，去除表面的农残及泥沙，清洗干净后去皮，压榨成汁；加入质量浓度0.08 kg/mL 果胶酶，于55 ℃下酶解120 min，提高柠檬出汁率，再加入质量浓度5 g/L β - 环糊精，于40 ℃下保温90 min，进行脱苦处理。将柠檬汁和绿茶汁1∶5（V∶V） 进行混合，同时将活化后的安琪果酒干酵母加入其中， 酵母接种量为7%（V∶V），调整混合发酵液糖度为20°Bx，pH 值3.6，置于发酵箱内28 ℃下恒温发酵7 d。

1.2.3 茶多酚含量的测定

茶多酚含量测定参照《GB/T 21733—2008 茶饮料》中附录A《茶饮料中茶多酚的检测方法》。

1.2.4 还原力的测定

采用普鲁士蓝法测定方法[11]，分别于5 支试管中准确加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 的柠檬绿茶酒，加入浓度0.2 mol/L pH 值6.6 的磷酸盐缓冲溶液2.5 mL，再加入质量分数1%的铁氰化钾溶液1.5 mL，混合均匀，于50 ℃水浴中反应20 min 后急速冷却，加入质量分数10%三氯乙酸2.5 mL，质量分数0.1%氯化铁1 mL 用体积分数30%乙醇定容至10 mL，静置10 min 后于波长700 nm 处测定吸光度A1。空白背景值以水代替氯化铁溶液，同上操作，测定吸光度A2。由公式（1） 计算其还原力，吸光度越高，说明还原性越好。

式中：A1——样品组吸光度；

A2——样品本底吸光度（以等体积的蒸馏水代替三氯化铁溶液）。

用不加茶叶发酵的柠檬酒作为空白对照，质量浓度0.1 g/L 的维C 溶液作为参照，测定方法同上。

1.2.5 超氧阴离子清除率的测定

参照张宏等人[12]的方法并稍作修改，分别于5 支试管中准确加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 的柠檬茶酒，加蒸馏水补至1 mL，加入于25 ℃水浴中预热20 min 的Tris-HCl 缓冲溶（pH 值8.2） 4.5 mL，浓度25 mmol/L 邻苯三酚溶液0.4 mL，混合均匀后于25 ℃水浴中反应5 min，然后加入浓度8 mol/L HCI溶液1 mL 终止反应，于波长299 nm 处测定吸光度A1。空白对照以蒸馏水代替样液，测定吸光度A0。以同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液，测定样液在体系中的吸光度A2。按公式（2） 计算清除率：

式中：A0——空白的吸光度；

A1——样液的吸光度；

A2——样液在体系中的吸光度。

用不加茶叶发酵的柠檬酒作为空白对照，质量浓度0.1 g/L 的维C 溶液作为参照，测定方法同上。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的测定

参照何婷婷[13]的方法并稍作修改，分别于5 支试管中准确加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL 的柠檬茶酒，加入浓度0.2 mol/L DPPH - 甲醇溶液2.0 mL，加入甲醇补至4 mL，室温下避光放置30 min，于波长517 nm 处测其吸光度A1，以甲醇作参比。对照组以等体积蒸馏水代替样液，同上操作，测吸光度A2。空白背景值以等体积的无水甲醇代替DPPH - 甲醇溶液，测得吸光度A0。按公式（3） 计算清除率，清除率越大抗氧化能力就越强。

式中：A0——2.0 mL 甲醇水溶液吸光度+酒样+甲醇补至4 mL 的吸光度；

A1——2.0 mL DPPH 溶液+酒样+甲醇补至4 mL 的吸光度；

A2——2.0 mL DPPH 溶液+ 2.0 mL 甲醇的吸光度。

用不加茶叶发酵的柠檬酒作为空白对照，质量浓度0.1 g/L 的维C 溶液作为参照，测定方法同上。

1.3 试验数据与处理

所有试验平行3 次及以上，数据采用2010 版Excel 进行处理。

2 结果与分析

2.1 茶多酚含量的变化

发酵过程茶多酚含量的变化见图1。

由图1 可知，随着发酵天数的增加，茶酒中茶多酚的含量由818.94 mg/kg 降低至438.24 mg/kg。在发酵过程中，由于柠檬绿茶酒中含有的茶多酚、咖啡碱、蛋白质等成分，发生络合反应形成聚合物，使得柠檬绿茶酒中的茶多酚含量逐渐降低[14]。

2.2 还原力的测定结果

图1 发酵过程茶多酚含量的变化

根据普鲁士蓝法进行测定，通过观察显色反应吸光度的高低来反映柠檬绿茶酒的还原能力的强弱。

柠檬绿茶酒、维C 的还原力见图2。

图2 柠檬绿茶酒、维C 的还原力

由图2 可知，柠檬绿茶酒的还原力随着其用量的增加而增强，且表现出一定的量效关系。与维C相比，在相同的用量下，柠檬绿茶酒表现出的还原力更强，且增长速度更快。在相同用量（0.5 mL）时，柠檬绿茶酒和维C 于波长700 nm 处的吸光度分别为0.504 和0.361，这说明柠檬绿茶酒具有较强的还原能力。

2.3 清除超氧阴离子能力的测定

柠檬绿茶酒、维C 清除超氧阴离子的能力见图3。

图3 柠檬绿茶酒、维C 清除超氧阴离子的能力

由图3 可知，柠檬绿茶酒和维C 均表现出较好的清除超氧阴离子的能力，且随着用量的增加，其清除超氧阴离子的能力也随之增加，但两者相比较下，维C 具有更强的清除超氧阴离子的能力。在相同用量（0.5 mL） 时，柠檬绿茶酒和维C 的清除率分别为67.68%和76.53%，说明柠檬绿茶酒具有较强的超氧阴离子清除能力。

2.4 清除DPPH 自由基能力的测定

柠檬绿茶酒、维C 对DPPH 自由基的清除能力见图4。

图4 柠檬绿茶酒、维C 对DPPH 自由基的清除能力

由图4 可知，柠檬绿茶酒和维C 均对DPPH 表现出一定的清除能力，且随着用量的增加，其清除能力也随之增加，且在试验选定的用量范围内，对于DPPH 自由基清除，维C 比柠檬绿茶酒的能力更强。在相同用量（0.5 mL） 时，柠檬绿茶酒和维C的清除率分别为79.36%和82.93%，说明柠檬绿茶酒具有更强的DPPH 自由基清除能力。

3 结论

柠檬绿茶酒具有一定的还原力、清除超氧阴离子的能力及清除DPPH 自由基的能力，且与维C 相比，柠檬绿茶酒的还原力更强，柠檬绿茶酒具有一定的抗氧化活性，适量饮用柠檬绿茶酒或许可减少自由基引起的机体损伤，有利于保护机体免受或减少氧化应激引起的疾病。