尿源性干细胞及其在软骨与骨组织工程中的应用进展

李嘉，万莎，田臻，林科夫，李浪

西藏自治区人民政府驻成都办事处医院骨科，成都610041

目前软骨和骨缺损的修复依然是临床中的一大难题，软骨和骨损伤若未及时治疗，缺损将持续增大，最终引起骨关节炎［1-2］。临床上治疗软骨和骨缺损损伤的传统手术方法主要有两种，微骨折技术［3］，但手术有热灼伤、软骨下骨骨折等不良反应；软骨或骨移植（自体或异体）［4-5］，自体移植物修复的效果良好，但会增加供区手术创伤和患者的痛苦，移植物供体来源有限，移植后有不同程度的宿主免疫排异反应，增加感染风险。组织工程学已经成为一种用于骨修复和再生的新疗法。组织工程学旨在通过工程学、生物学原理和技术，以种子细胞和生长因子协同组合来诱导新的功能性骨再生。骨髓间充质干细胞（BMSC）、胚胎干细胞等被广泛运用于软骨与骨组织工程。然而，BMSC 需通过抽取骨髓获得，胚胎干细胞的应用又受畸胎瘤形成风险和伦理学的困扰［6-9］。因此目前需寻求易获得且丰富的干细胞来源。人尿源性干细胞（hUSC）是从尿液中得到的一种成体干细胞。在定向诱导下，可分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。hUSC 具有来源广泛、培养简单的优点，这使hUSC 作为种子细胞在组织工程中应用具有强大潜力。目前关于hUSC 在软骨与骨组织工程中的应用已有相关研究报道，现综述如下。

1 hUSC概述

1.1 hUSC的来源及定向诱导分化 干细胞的形态一定程度上能够代表其来源，因为细胞的形状取决于细胞的性质。目前hUSC 主要有四种形态：米粒样、纺锤样、圆形及多角形，偶可见拉丝状细胞。这些形态与之前报道的尿路上皮样细胞具有相似的形态，说明hUSC有可能来源于尿路上皮细胞。

干细胞的表型鉴定主要通过流式细胞学检测，目前多项研究表明hUSC 的表面标志物类似于MSC和外周细胞，而非造血干细胞。流式细胞学结果显示，hUSC 表达 MSC 样细胞表面标志物（SSEA-4、CD44、CD54、CD73、CD90、CD105、c-kit），很少表达CD133、CD31、CD34，几乎不表达CD45；此外，超过90% 的 hUSC 表达外 周细胞标 志物（CD146）［10］，62.3%的hUSC 表达SSEA-4，表明其具有较强的干细胞潜能，同时CD34、CD45和c-kit均为阴性。这说明hUSC 是非造血细胞来源，只有不到3%的细胞表达免疫标志物（HLA-DR），提示其对同种异体移植的低免疫排斥。

hUSC 来源广泛，获取方便，具有较强的分化潜能。ZhANG 等［10］发现，hUSC 在连续培养后可保持正常的核型，具有表达尿路上皮细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和间充质细胞标记物的细胞谱系的能力。

1.2 hUSC 的提取及培养 hUSC 来源于新鲜尿液，REN 等［11］研究结果发现，75% 的新鲜 hUSC 可以安全地在尿液中保存24 h，并且这些细胞依然具备平滑肌细胞以及尿路上皮细胞的分化能力。USC的培养基体系较为复杂，包括DMEM 高糖培养基、KFSM及因子、F12、胎牛血清、牛垂体提取物、表皮生长因子、胰岛素、腺嘌呤、谷氨酸、转铁蛋白、地塞米松、双抗等，培养基的成本较其他细胞略高。hUSC提取主要采用离心贴壁法，离心力为常温下400～500 g、5～10 min［10，12-13］，但在后期细胞扩增和活性上无明显区别。观察到贴壁的 hUSC 的时间为 2～7 d［14-15］。原代细胞一般10～15 d融合率可达80%～90%，2～3 d可实现传代。

1.3 hUSC 的优势 多项研究表明，hUSC 呈曲线生长，可分为潜伏期、对数期和平台期3 个时期［13］。KANG 等［16］对同一供体提取的 hUSC 和脂肪来源干细胞（ADSC）对比发现，hUSC 比 ADSC 的细胞增殖效率更高。P2～P7代USC 端粒酶长度随着传代不发生明显变化，而BMSC 随细胞传代端粒酶长度逐渐缩短。以上结果说明，hUSC具备更长的端粒酶长度以及更高的端粒酶活性。

韩国的 KANG 等［16］提取 hUSC 及 ADSC，同代细胞相较，hUSC 具有较高的细胞增殖率、更强的集落形成能力、较强的干细胞标记表达阳性率及更高的抑制免疫细胞激活效率；在染色体稳定性分析中，两种细胞在所有传代中均表现出正常的核型；多系诱导发现，hUSC 表现出较高的成肌、成神经和成内皮细胞分化率，但成脂、成骨及成软骨的分化率更低。

在一定条件下，分别用hUSC 和BMSC 同尿路上皮细胞培养，60%～70%的hUSC 可以表达尿路上皮特异性蛋白与基因，远高于BMSC 诱导分化效率；另外hUSC 诱导分化的尿路上皮细胞，可以表达相关的基因蛋白ZO-1、E-钙黏蛋白和扣带蛋白，同时具备与膀胱组织细胞相似的屏障功能。

2 hUSC在软骨和骨组织工程中的应用

2.1 hUSC在软骨组织工程中的应用 多项研究发现，hUSC在体外诱导成软骨培养，28 d后可表达成软骨的相关基因及蛋白［17-18］。PEI等［19］报道，BMSC经过多次传代后其软骨分化能力会下降，hUSC分泌的细胞外基质可以改善并增强BMSC 的软骨分化能力。王远政等［20］研究也表明，hUSC能成功诱导成软骨。

CHEN［21］在体外做 hUSC 成软骨诱导后发现，hUSC可分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，两者皆为软骨表达的相关蛋白。该研究还将hUSC 与可注射透明质酸（HA）结合，并将hUSC-HA、HA 和单纯hUSC 注射到兔膝关节、修复股骨髁软骨缺损。12 周后发现，hUSC-HA具有更强的软骨修复能力。

目前关于hUSC 修复软骨的报道仍然较少，需进一步研究更加有效的诱导方法，争取早日将其应用于临床。

2.2 hUSC在骨组织工程中的应用 骨缺损是修复的难题，广大学者也在组织工程三要素中极力探索，种子细胞是其重要环节。目前用于临床的干细胞如BMSC、软骨细胞等的获取都要产生创伤，且具有潜在的并发症。hUSC 为无创获取的干细胞，来源广泛，可作为骨组织工程的潜在细胞。

体外研究表明，hUSC通过诱导发现有成骨细胞表达。骨形态发生蛋白（BMP）转染hUSC 可提高其成骨能力［18］。GUAN 等［22］发现，经 BMP-2 转染的hUSC 高表达Runt 相关蛋白-2 和骨钙素，而且较其他组有更多的新骨形成。XING 等［23］使用表面矿化的双相磷酸钙陶瓷（BCP）负载hUSC 修复新西兰兔的临界骨缺损，结果表明表面矿化BCP 在不影响hUSC 增殖的情况下，可促进hUSC 的成骨蛋白和基因表达，10 周后，负载hUSC 的表面矿化BCP 组的新骨形成量最高。

有研究将hUSC 接种在β 磷酸三钙三维支架上（β-TCP），结果表明hUSC 在支架内成骨分化［24］。将细胞支架复合物植入修复大鼠6 mm的股骨缺损中，结果表明，支架复合hUSC 组内可见大量新骨形成，较单纯β-TCP支架组及空白组其成骨力能更强。该团队又用硅酸盐、聚乳酸生物陶瓷复合支架（PLGA／CS）复合hUSC，并将细胞支架复合物植入裸鼠皮下，结果显示硅酸盐离子明显增强了细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、钙沉积和某些成骨基因及蛋白的表达，组织学分析表明，PLGA/CS 复合支架能显著促进 hUSC 在体内的成骨分化［25］。QIN 等［26］发现，4 μg/mL 的银纳米粒子（AgNP）可促进hUSC 诱导肌动蛋白聚合，增加细胞骨架张力，激活ras 同源家族成员A，因此适当浓度AgNP 可以促进hUSC 的成骨分化。该研究认为hUSC 可以作为骨组织工程种子细胞，银离子可作为一种组织工程支架。可见，hUSC 具备与支架材料黏附、爬行及增长的能力，可作为骨软骨组织工程的种子细胞。

综上所述，hUSC 具有上皮干细胞的特性，在诱导成肌肉、成上皮、成神经的能力方面较其他的干细胞更强，但在诱导成骨、成脂和成软骨能力方面，还需要进一步探索。