胶质瘤对替莫唑胺耐药机制的研究进展

杨开，王春红 ，成睿，吉宏明

1 山西医科大学第五临床医学院，太原030001；2 山西医科大学附属人民医院神经外科

世界卫生组织的中枢神经系统胶质瘤分级中，Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别胶质瘤，其中Ⅳ级为胶质母细胞瘤（GBM）［1］。由于胶质瘤发病位置特殊，正常脑组织与肿瘤组织之间界限模糊，外科治疗彻底清除病灶组织难度系数大，治疗效果差且易复发，病死率极高［2］。临床以手术切除肿瘤为主，术后替莫唑胺（TMZ）联合同步放疗已成为新诊断 GBM 的标准治疗方案［3］。GBM 多采用 TMZ 化疗，低级别的胶质瘤存在高危因素也推荐使用TMZ化疗。TMZ 是一种新型的口服烷基化剂。随着化疗的进行，大多数患者最终会对TMZ 产生耐药性。因此，迫切需要了解TMZ 耐药机制。目前研究发现，胶质瘤对TMZ 耐药的机制多样，本文对其中大部分机制进行综述。

1 DNA损伤修复参与的耐药机制

1.1 O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT） 在 TMZ 引起的DNA 甲基化修饰中，O6-甲基鸟嘌呤修饰的毒性最大，在TMZ 诱导的胶质瘤细胞死亡中有重要作用。MGMT是一种由MGMT基因编码的DNA 修复酶，TMZ 诱导的O6-甲基鸟嘌呤的DNA修饰可被MGMT逆转，能去除DNA烷基化加合物，从而修复受损的DNA，促进胶质瘤对TMZ 的耐药性［5］。MGMT 的蛋白表达可被 MGMT 基因的启动子甲基化表观遗传沉默，与疾病预后相关。MGMT启动子甲基化状态是预测GBM 预后的生物标志物，但其在GBM患者治疗中的价值仍存在争议。

1.2 DNA 错配修复（MMR） 如果在细胞分裂前未除去甲基，则会触发MMR 途径，MMR 修复了MGMT未修复的O6-甲基鸟嘌呤病变。子链上错配胸腺嘧啶被MMR 主动识别并切除，但O6-甲基鸟嘌呤仍然存在于模板链中，之后胸腺嘧啶重新插入和切除的无效循环导致持续的DNA 链断裂，从而导致复制叉塌陷，最终会导致细胞凋亡［6］。MMR 缺陷细胞无法切除新合成的子链，使肿瘤细胞继续增殖，最终导致对TMZ 介导的细胞毒性产生抵抗。MutS 是MMR 系统中起关键作用的修复蛋白，MutS 突变会有助于TMZ治疗胶质瘤的复发和耐药。

1.3 碱基切除修复（BER） 活性氧、电离辐射和烷化剂等会导致细胞产生小片段的受损核苷酸、暴露的碱基位点以及导致DNA 单链断裂，BER 是参与其去除和修复的主要途径。TMZ 对N7-甲基鸟嘌呤的甲基化会立即被BER 途径中的DNA 修复酶多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）修复，因此导致TMZ耐药［7］。PARP抑制剂类药物可用于对抗TMZ耐药。

2 细胞信号通路异常介导的耐药机制

2.1 p53 介导的信号通路 p53 是一种由TP53 基因编码的肿瘤抑制蛋白，TMZ 治疗胶质瘤引起的一系列相关DNA 损伤反应最终会激活p53，使p53 发挥肿瘤抑制因子的功能。小鼠双微体2 同源物（MDM2）是一种E3 泛素蛋白连接酶，其表达被蛋白激酶B（Akt）上调，Akt 在受体酪氨酸激酶（RTK）激活的下游发挥作用，进而负向调节p53蛋白的表达。p53 的直接基因改变或p53 与MDM2 蛋白之间的相互作用是p53 功能失活的两种机制［8］。肿瘤抑制因子p14ARF 可竞争性的与MDM2 结合，阻断p53 与MDM2 相互作用，从而上调p53 表达。肿瘤抑制酶张力蛋白同源物（PTEN）能抑制MDM2 转录使p53不被降解失活，同时也可以使TP53基因的转录活性增强，其突变导致肿瘤细胞增殖增强。PTEN 和p53的关联可以增强肿瘤细胞对TMZ的敏感性［9］。半乳糖凝集素（Gal1）属于凝集素家族，其表达会因缺氧刺激而增加，Gal1 能调节修饰p53 的生物学功能，Gal1 还可作用于Ras 相关通路，导致对化疗的耐药性［10］。以上均说明 p53-MDM2 轴在 DNA 损伤介导的耐药中起作用，TP53 基因的突变导致促进肿瘤细胞生长和对TMZ 的抵抗，通路相关环节的抑制可能成为将来对抗耐药的靶点。

2.2 活性氧（ROS）介导的信号通路 TMZ 通过过氧化物酶体、微粒体和线粒体氧化产生细胞内ROS，其引发的DNA 双链断裂也会产生次级ROS。ROS会激活多个应激反应信号通路，还可直接或者间接损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等物质的生理功能，是众多疾病发生的病理基础［11］。胶质瘤细胞可能在ROS 产生过程中发挥作用，以保护TMZ 诱导的细胞死亡，导致耐药性的产生。当TMZ 介导细胞死亡信号时，ROS 最初激活 c-JUN 氨基末端激酶（JNK），JNK活化可强效诱导胶质瘤细胞中MGMT表达和桩蛋白活化，促进DNA 修复和胶质瘤细胞的侵袭［11］。ROS 介导的信号通路，在TMZ 耐药机制中占重要地位，相关药物的联用也在一定程度上提高了胶质瘤治疗的疗效。

2.3 内质网应激和自噬相关信号通路 在经典的靶向DNA 损伤外，TMZ 还引起脱靶效应，即内质网应激反应（ERSR），调节GBM 化学敏感性。TMZ 介导 ROS 产生也能诱导胶质瘤细胞 ERSR［12］。当ERSR 被激活后，蛋白激酶R（PKR）样内质网激酶（PERK）随后被激活，PERK 被激活有助于促进胶质瘤细胞的生长。在轻度ERSR 下，多种细胞保护作用可导致神经胶质瘤细胞对TMZ 的耐药性。而在持续和严重的ERSR 下，细胞稳态无法恢复，导致各种途径的激活。ERSR 有一重要下游目标，即自噬，其通过参与线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径的关键步骤，参与对关键蛋白质的调节，而具有促肿瘤细胞生存的作用，为细胞提供代谢的底物，并使其对化疗具有耐药性［13］。在临床治疗中，抑制自噬可显著增加TMZ导致的细胞凋亡。

2.4 RTK 相关信号通路 RTK 的致癌活化是维持胶质瘤细胞致癌性的关键信号。在正常细胞中，RTK 结合胞外特异性配体，并在质膜中自我二聚化，从而诱导RTK 的C 末端胞内激酶结构域的自身磷酸化，磷酸化的RTK 激活下游各种细胞信号分子，诱导细胞增殖与侵袭［14］。磷酸酶对RTK 介导的信号传导具有重要的调节作用，PTEN 通过抑制磷酸肌醇3-激酶（PI3K）影响下游信号。除PTEN 外，已知磷酸酶PP2A 通过去磷酸化阻断Akt、ERK1/2和其他信号分子（如c-Myc），在调节RTK 介导的信号中发挥作用，PP2A 作为肿瘤抑制因子被广泛认可［15］。胶质瘤RTK 及其下游相关通路的异常激可导致其对TMZ 产生耐药性。三条主要通路总结如下。

2.4.1 RTK-Ras-Raf-MEK-ERK 信号通路 细胞外的信号刺激原癌基因Ras，使其与三磷酸鸟苷结合而激活，进而磷酸化激活Raf，之后Raf 再激活有丝分裂原激活蛋白激酶（MEK），MEK 经磷酸化激活细胞信号调节蛋白激酶（ERK），最终驱动基因表达［16］。活化的ERK 催化许多胞质效应器和核转录因子的磷酸化，从而诱导细胞存活、迁移和增殖［17］。抑制该通路的异常激活，能有效抑制胶质瘤细胞的增殖，改善TMZ耐药。

2.4.2 RTK-PI3K-Akt-mTOR 信号通路 PI3K 是活化的RTKs 磷酸化磷酸肌醇3-激酶，将磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3在质膜上招募3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）和蛋白激酶B（Akt），之后PDK1 磷酸化Akt，导致Akt 活化。磷酸化的Akt 激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）蛋白复合体，mTORC1蛋白复合体是控制能量和氧化还原反应的主要调节因子之一，对胶质瘤细胞的致癌特性有积极贡献［18］。此通路通过诱导肿瘤血管生成，诱导自噬以及参与肿瘤的增殖、迁移等，导致肿瘤细胞对TMZ耐药。

2.4.3 酪氨酸激酶Janus 激酶（JAK）-转录激活因子（STAT）信号通路 RTK 活化后，JAK 发生酪氨酸磷酸化，将STAT 募集至RTK 胞质结构域的磷酸酪氨酸残基，酪氨酸磷酸化STAT，并通过与其他STAT形成同源二聚体或异源二聚体释放到细胞质中，寡聚化的STAT 被ERK1/2 进一步磷酸化，并穿梭到细胞核中，最终与靶基因的启动子结合并启动转录，导致细胞增殖和迁移［19］。JAK 还与酪氨酸磷酸化的接头蛋白结合，通过RTK 活化，激活Ras 介导的通路。在TMZ 耐药的胶质瘤中STAT3 活化增加，在这些胶质瘤中靶向 STAT3 克服了 TMZ 耐药［20］。胶质瘤中STAT 的致癌激活可能主要由RTK 相关机制的过度激活触发，并可能增加了胶质瘤的治疗难度。

2.5 转化生长因子β（TGF-β）介导的信号通路 TGF-β 介导的信号传导是胶质瘤生物学方面重要调节机制之一。在健康细胞和早期癌细胞中，TGF-β 通路具有肿瘤抑制功能，包括促进细胞周期停滞和凋亡；而其在晚期癌症中的激活可促进肿瘤发生，包括转移和化学耐药性。上皮—间质转化（EMT）可减少各种癌症的细胞间黏附，与TMZ 耐药性有关，可被 TGF-β 激活。TGF-β 信号传导途径是由 TGF-β 与 TGF-βRⅡ结合而引发的，后者会募集TGF-βRⅠ并使其磷酸化，随后激活SMAD 信号通路，之后通过激活PI3K/AKT 和RAS/MAPK 通路获得致癌性突变，从而选择性地抵抗TGF-β 的细胞生长抑制作用或p53 途径［21］。结缔组织生长因子（CTGF）是属于 CCN 家族的分泌蛋白质。TGF-β 通过SMAD 和 ERK1/2 信号通路调控 CTGF；CTGF 通过促进抗凋亡生存蛋白和转换酶抑制蛋白的表达，或抑制促凋亡PARP 表达，赋予TMZ 抗药性。靶向TGF-β/CTGF 信号轴可能为克服TMZ 耐药提供新策略。

2.6 Wnt/β-Catenin 信号通路 Wnt 信号通路在中枢神经系统发育的不同阶段发挥至关重要的作用，并且其通路活化会导致TMZ 耐药。LncRNA参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及化疗耐药。LncRNA-H19 在耐TMZ 的神经胶质瘤细胞中高表达，而 LncRNA-H19 沉默可通过 Wnt/β-Catenin 途径抑制胶质瘤细胞的EMT，从而降低其对TMZ 的化学耐药性［22］。

3 胶质瘤干细胞（GSC）参与的耐药机制

GSC 可以自我更新、不断分化、无限增殖，其被认为是胶质瘤进展和耐药性的原因之一。SOX9 是在大多数实体瘤中表达的转录因子，过表达SOX9可抑制细胞凋亡，且促进其增殖、侵袭和迁移；敲低GBM 细胞系中的SOX9 明显抑制了干细胞样特性，包括干细胞标志物表达和神经胶质瘤细胞球形成，表明 SOX9 会调节 GSC 的自我更新［23］。丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）是 SOX9 的下游目标，PDK1 的活性影响了GBM 中GSC 的自我更新，其失活抑制了胶质瘤细胞球的形成，并极大地使胶质瘤球对TMZ 敏感。磷酸化AKT 的水平受PDK1 活性的调节，这也对TMZ 的耐药性有影响［24］。总之，SOX9-PDK1轴是GSC 自我更新的关键调节途径，在TMZ 耐药性中占有重要地位。

4 肿瘤微环境（TME）参与的耐药机制

4.1 低氧微环境 低氧被认为是EMT 的主要特征，能通过多种机制来激活EMT 相关信号通路，例如上调EMT 相关转录因子、阻遏物表达；低氧条件下，NF-κB 和 Notch 直接触发 EMT 的信号传导途径也被激活，且低氧会增加ROS水平，从而通过TGF-β信号通路促进细胞增殖并诱导EMT［25］。缺氧诱导因子（HIF）是与缺氧相关的最重要的转录因子，HIF-1α 可促进GBM 在缺氧条件下的恶性进展，HIF靶向治疗与TMZ 联用减少了肿瘤的发生，并显著提高了化疗敏感性。HIF-1α/HIF-2α/miR210-3p 网络通过与表皮生长因子的正反馈循环促进GBM 的恶性进展，还使分化后的GBM 细胞脱分化，产生GSC；敲除HIF可抑制细胞周期停滞，促进细胞增殖，进而促进GBM 的化疗增敏［26］。可见低氧微环境会介导化疗耐药，这对GBM的治疗具有重要意义。

4.2 外泌体（EXO） EXO 是一种囊泡，由机体释放，内部容纳与供体细胞相关的蛋白质以及核酸，可通过内吞作用被细胞吸收。EXO 在促进肿瘤迁移、侵袭、血管生成和影响耐药等方面有着重要的作用，并且能够影响EMT。神经胶质瘤细胞以非接触方式刺激星形胶质细胞进入反应性星形胶质细胞（RAS），其释放的EXO 中MGMT mRNA 表达显著增加。MGMT 阴性神经胶质瘤细胞可摄取RAS EXO，并通过翻译外源性EXO MGMT mRNA 获得耐TMZ的表型。研究发现，lncRNA SBF2-AS1 的表达在耐TMZ 的GBM 细胞和组织中被上调，GBM 细胞通过分泌富含此致癌物质的EXO 来重塑EMT，从而促进肿瘤对 TMZ 的耐药性［27］。针对 EXO 设计的靶向药物或许会成为解决耐药的重要手段。

5 表皮生长因子受体（EGFR）参与的耐药机制

EGFR 是一种蛋白激酶，可促进肿瘤增长、进展侵袭、血管生成、化学耐药等，其在肿瘤的发生发展中发挥巨大的作用。EGFR 与配体的结合能激活Ras/Raf/ERK 通路或 PI3K/AKT/mTOR 通路，引起细胞自噬和凋亡的抑制，造成TMZ 效率的下降。EGFR 表达的降低以及对其通路的抑制将会抵抗TMZ耐药。

6 微小RNA（miRNA）参与的耐药机制

miRNA 参与转录后基因的表达调控，可作为一类新的癌基因或抑癌基因而发挥作用。近年来测序发现，miR-21、miR-195 等在耐药细胞系中表达上调，而miR-145、miR-186 等在胶质瘤耐药细胞系中表达下调［6］。miRNA 种类繁多，其调控网络十分复杂，miRNA的突变、异常表达会导致耐药。

胶质瘤对TMZ 耐药的机制错综复杂，未发现的机制、治疗中只对单一靶点的作用、全身给药的策略以及各机制的补偿作用等，导致解决TMZ 耐药的结果并不理想。今后的研究还要着手于对未发现机制的探索以及治疗策略的改进。