Caspase信号途径及其在乳腺癌治疗中的作用研究进展

王 敏，李习平，杨 梅，齐 玲，张珍达，谢 薇

(贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，全球每年新发病例约167.1万，每年病死病例约52.2万。而在我国，乳腺癌每年新发病例约21万，居女性恶性肿瘤之首，且近年来发病率呈逐年上升趋势[1-3]。然而在乳腺癌当下的治疗中，尽管方法不尽相同，但结果却大同小异，依然呈现出高复发、高转移和高死亡率等特点。因此，对乳腺癌发生、发展及转移机制的进一步阐明对乳腺癌的继续研究及防治至关重要。目前研究表明，乳腺癌具有多种分子亚型，且不同亚型对于化疗、放疗及靶向药物等治疗方式的敏感程度亦不尽相同。此外，目前在乳腺癌相关生物信息学方面的研究亦取得较大进步，不仅发现了一系列与乳腺癌相关的调控通路及信号因子，还对基因间相互作用做了较为系统的研究，从而为其早期诊断、分级治疗和靶向药物选择提供了更为坚实的理论依据[4]。研究[5]指出，细胞凋亡异常是肿瘤、自身免疫疾病和神经退行性病变等发生和发展的重要影响因素。而正常的细胞凋亡程序亦是多细胞有机体维持体内平衡和发育过程的一个重要机制，其在肿瘤发生、发展中的负调控作用能够有效遏制肿瘤细胞的增殖。已有研究[6]发现，在大多肿瘤组织(包括卵巢肿瘤、乳腺癌、胰腺癌和肝癌等)细胞中均存在 Caspase 系列蛋白(如Caspase-3、8、9等)异常表达，甚至某些Caspase家族蛋白在凋亡调节中起着重要的枢纽作用。现利用文献总结Caspase信号通路在乳腺癌临床治疗中的研究进展，并进一步讨论其在乳腺癌靶向治疗中的临床策略。

1 Caspase信号途径概述

1.1 Caspase蛋白家族及分类 1993年，Yuan等发现秀丽隐杆线虫(C.elegan)中的Ced-3基因与Ced-4基因是引导细胞凋亡的必经途径，而哺乳动物中的IL-1β转化酶(ICE)在功能和序列上又与Ced存在高度相似性，且都与细胞凋亡的诱导息息相关，故两者在后来被统称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate-specific proteinase，Caspase)。研究发现，所有Caspases均具N-端的半胱氨酸激活位点及底物裂解位点，其底物特异性由其裂解位点N-端的4个氨基酸残基决定，底物裂解部位通常位于靶蛋白一级结构中的门冬氨酸残基且数目不等。目前，在哺乳动物中已发现并克隆的Caspase系列蛋白酶共14种，按其在凋亡调节中作用的不同分为三类：①炎症介导因子(如Caspase-1、4、5、11)除了介导炎症反应外，还在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起着重要的辅助作用；②凋亡启动因子处于级联反应的上游，能够接受上游凋亡信号发生自我活化和特异识别并激活下游凋亡效应Caspase，包括Caspase-2、8、9、10等，其中Caspase-8对几乎所有效应Caspase分子均能激活而诱发凋亡[7]；③凋亡执行因子亦称凋亡效应因子，处于级联反应下游，主要承担细胞凋亡过程，如Caspase-3、6、7，其中Caspase-3是细胞凋亡过程中的主要效应因子，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的一个重要标志[8]。

1.2 Caspase信号传导相关凋亡途径 目前，已知凋亡所涉途径共有4条，分别为内源性途径、外源性途径、内质网途径及颗粒酶B途径。近年来，针对前两种途径的研究较多，而在颗粒酶B途径和内质网途径的了解上则相对较为薄弱。虽然4种途径均有Caspase参与，但Caspase主要通过内源性和外源性途径发挥凋亡调控作用。为了更为系统地了解细胞凋亡的调控机制，现就上述4种凋亡途径及其常见调节信号因子进行综述。

1.2.1 内源性途径：该途径又称线粒体通路，通过胞内的死亡信号刺激线粒体外膜，诱导线粒体膜通透性发生改变，致使跨膜电位丢失，继而释放细胞色素C与胞质中凋亡激活因子(Apaf-1)相结合，再进一步激活Caspase-9酶原并与之结合组成凋亡复合体，活化后的Caspase-9 特异性切割Caspase-3使其活化，最终通过活化的Caspase-3促进核纤层核碎裂、蛋白分裂，从而导致凋亡[9]。此途径众多调节蛋白中，Bcl-2家族是最为重要的调节因子之一，包含抗凋亡成员(如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-W等)和促凋亡成员(如Bax、Bik/Nbk、Bad、Bid等)两类，其凋亡调节作用取决于抗凋亡因子与促凋亡调节因子比中的优势方，继而通过细胞色素C的释放进行细胞凋亡过程的调节。此外，生长因子的缺失、氧化应激、钙超载、致癌因子激活以及DNA 损伤等因素均可激活内源性途径。除细胞色素C外，线粒体还释放核酸内切酶G、细胞凋亡诱导因子和凋亡抑制蛋白拮抗剂(SMAC)等，这些分子同样可以促进Caspase 依赖途径的细胞凋亡。

1.2.2 外源性途径：该途径又称为死亡受体途径或胞质途径，依赖膜结合配体FasL和死亡受体并最终通过激活执行者Caspase系列蛋白而触发凋亡。死亡受体系肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族重要成员之一。迄今共发现TNF受体30种，其中8种位于胞质内，被誉为“死亡域”，且TNF-R1、Fas(Apo1)、DR3(Apo2)、DR4(Trail-R1)、DR5(Trail-R2)及DR6这6种TNF的受体死亡域与Caspase凋亡途径的激活息息相关。该途径具体表现为：细胞膜外的FasL通过与细胞膜表面相应死亡受体结合构成死亡诱导复合物，继而激活Caspase通路，开启凋亡外源性途径。外源性途径影响因素众多，如Bcl-2蛋白家族、NF-κB、p53、死亡受体、细胞周期相关因子等，其中p53是一种能通过对前凋亡成员Bax、Bak产生直接或间接作用而发挥促凋亡功能的抑癌基因，但也有报道称某些突变体p53能够通过调节脱氧尿苷三磷酸酶表达而抑制凋亡。近年来研究表明，内、外两种凋亡调节途径并非总是相互独立的,亦可以相互交错形成共同途径，亦称Caspase信号途径。如在肝细胞凋亡的FAS应答途径中，由于Caspase-8的活化水平不足，受外源性途径激活的Caspase-8能够促使胞浆中的Bid激活并向线粒体迁移，通过内源性途径释放SMAC进一步激活起始酶Caspase-8，进而将外源性途径信号进一步放大，最终作用于执行酶Caspase-3，启动相应凋亡程序[10]。

1.2.3 颗粒酶B(GrB)途径：颗粒酶(Gr)是一类来自细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞的丝氨酸蛋白酶。目前，已知颗粒酶共11种，在人类发现有GrA、GrB、GrH、GrK和GrM共5种，其中GrB凋亡诱发活力最强[11]。该凋亡过程表现为：当CTL受到刺激后，以穿孔蛋白和GrB为主的毒性颗粒被释放到细胞外，通过多种途径作用于相应靶细胞并引发凋亡的发生。研究[12]发现，GrB的凋亡调节途径共有两条，分别是Caspase依赖途径和非Caspase依赖途径。GrB可以分别通过切割凋亡促进因子Bid和凋亡抑制因子Mcl-1激活内源性途径，诱发凋亡[13]。此外，GrB还可以直接迁移入核、直接激活除Caspase以外的胞浆底物或通过改变线粒体膜电位结构等非Caspase依赖性途径启动凋亡程序[14]。

1.2.4 内质网途径：内质网作为蛋白合成、加工以及Ga2+储存的重要场所，其在细胞凋亡调节中的作用近年来亦备受关注。目前已知，内质网主要通过Caspase-12、非折叠蛋白效应和内质网Ga2+异常3条途径参与细胞凋亡[15]。研究发现，内质网内过多积累的未折叠蛋白会特异性地与肌醇依赖酶1-α(Ire1-α)竞争BiP/Grp78，从而导致剩余Ire1-α与能特异吸附并激活Caspase-12的死亡受体相关因子TRAF2结合，进而开启凋亡过程。同时，Caspase-12也能被细胞内Ga2+激活的m-钙激活酶切割并激活，且激活后的Caspase-12能直接通过激活Caspase-9，绕开线粒体途径而诱发凋亡。此外，内质网途径在通过Caspase-12直接开启凋亡程序时，其释放的Ga2+还可以直接引起线粒体膜通透性及膜电位改变，导致线粒体凋亡物质的释放，从而启动和实施凋亡。有报道称，线粒体途径的细胞色素C能与Ga2+释放影响因子肌醇1,4,5-三磷酸(InsP3)直接结合，引起Ga2+通道开放，从而增强对线粒体通路和内质网通路的刺激，进一步促进凋亡的发生。由此看来，内质网途径与线粒体途径在细胞凋亡的调控中亦并不是完全孤立的，而是可以相互作用的[16]。目前对于Caspase-12的激活机制尚不明确，有研究[17]认为被活化的Caspase-12从内质网到细胞浆中首先作用于Caspase-9，再激活Caspase-3引起细胞凋亡，或Caspase-12直接激活了Caspase-3。而且，在近年对以上凋亡途径的研究中，尚未发现Caspase-12参与内、外源性途径，这亦证明内质网途径亦具有一定的Caspase选择特异性。

2 乳腺癌相关Caspase信号途径

乳腺癌相关Caspase信号途径受诸多凋亡调节因子的影响，尤以Bcl-2蛋白家族、TNF超家族、p53、凋亡蛋白抑制因子(IAP)、部分miRNA、人表皮生长因子受体2(HER-2)较多。但在不同途径中的优势调节因子不尽相同，且机制各异。

2.1 Caspase相关内源性途径与乳腺癌 Caspase相关内源性途径与乳腺癌关系的调节作用主要表现为Bcl-2相关途径。Talaiezadeh等[18]通过小干扰RNA介导的Bcl-2基因阻断来处理乳腺癌细胞MCF-7，发现癌细胞生存率显著降低，并且这一效应在24 h最为明显，说明了Bcl-2信号通路在乳腺癌的发生、发展中具有重要作用。Bcl-2作为最重要的凋亡调控因子之一，其表达受雌激素(ER)的调节[19]，且研究[20]指出存在ER/PR表达的乳腺癌组织对内分泌抗癌治疗较为敏感。同时，黄信等[21]通过对乳腺癌组织中Bcl-2表达的研究亦发现，高表达Bcl-2的乳腺组织往往恶性程度较低，且对内分泌治疗方法较敏感，因而具有更为乐观的预后，并且分析了其原因可能包括：①Bcl-2在抑制凋亡的同时延长了细胞周期，从而在减缓增殖的基础上减缓了肿瘤基因的变化，使得预后更好；②由于ER阳性乳腺癌对内分泌治疗敏感，而Bcl-2的表达又受ER的调节，因此Bcl-2高表达的乳腺癌组织对内分泌调节治疗较敏感，且预后较好；③可能由于其他一些如p53、Ki67及表皮生长因子受体等负性调节因子的影响，导致Bcl-2高表达的乳腺癌组织恶性程度通常较低，因而预后更为乐观；④有可能随着乳腺癌的发展，某些基因取代了Bcl-2的相关效能，导致Bcl-2低表达的乳腺癌组织恶性程度高而预后较差的结果。

2.2 Caspase相关外源性途径与乳腺癌 外源性途径研究中Fas及其相关配体FasL和TNF-R1备受关注。研究[22]发现，Fas及其配体FasL在诱导细胞凋亡的过程中具有重要意义，其中肿瘤FasL在T淋巴细胞的凋亡中就具有重要的诱导作用。李艳萍等[23]研究得出，Fas/FasL的表达与乳腺癌的发生、发展具有一定相关性，随着乳腺癌病情的发展，Fas蛋白的表达率呈逐渐下降趋势，而其配体FasL的表达则逐渐升高。同时，许晔琼等[24]在Fas/FasL基因多态性与乳腺癌发生关系的研究中发现，Fas基因启动子-1377G>A和-670A>G以及FasL基因启动子-844T>C基因型的多态性均与乳腺癌的发病具有一定的相关性。另外，TNF-R1作为肿瘤细胞微环境中介导TNF-α效应的主要受体，广泛存在于正常细胞及多种肿瘤细胞的表面[25]。研究[26]发现，内化的TNF-R1死亡复合物能够触发Caspase-8介导的凋亡效应，从而发挥抗炎、抗肿瘤效应。但同时，还有报道[27]称TNF-R1可以通过激活NF-κB而发挥抗凋亡作用。金莲锦等[28]通过TNF-R1在乳腺癌中表达的研究发现，TNF-R1在乳腺癌中呈高表达状态，而在TNF-R1凋亡机制的研究中，当抑制MCF-7细胞中TNF-R1表达时，胞内Caspase-8的表达出现明显升高，而NF-κB则明显下降，该结果提示MCF-7细胞中高表达的TNF-R1很有可能通过NF-κB信号途径的激活抑制了Caspase-8通路的凋亡作用。然而，关于外源性途径中各因子与乳腺癌发生、发展相关的确切机制还有待进一步研究确定。

3 乳腺癌Caspase信号途径相关药物治疗

随着乳腺癌凋亡机制研究的不断深入，各种药物的作用机制亦不断清晰，对于凋亡的调控作用亦更为明了。在目前已知的四条主要凋亡途径中，几乎均有Caspase信号途径的参与。黄茂杰等[29]研究发现，利用乳岩内消霜透皮液干预MCF-10AT细胞可使Bax/Bcl-2比值明显上升，活化的Caspase-9、Caspase-3及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达亦明显上调，足以证明乳岩内消霜透皮液很可能通过对上调Bax/Bcl-2促进了细胞色素C的释放，进而激活Caspase级联反应，诱发MCF-10AT细胞的凋亡。同时，王俊等[30]发现枸杞总黄酮(TFL)能够促使MCF-7 细胞中Caspase-3 mRNA的表达逐渐升高，同时使Bcl-2 mRNA逐渐下降，进而通过线粒体凋亡途径实现MCF-7 细胞的凋亡。吴颖等[31]研究发现，阿司匹林处理乳腺癌AU-565和MDA-MB-231细胞后，可分别促进裂解型Caspase-3和PARP表达的上调，而抗凋亡Bcl-2表达下调，表明Bcl-2/Caspase-3/PARP这一信号通路被激活，调控乳腺癌细胞的凋亡活动。田杰等[32]发现，土槿皮乙酸(PAD)可激活Caspase-8 和Caspase-9凋亡途径，同时亦可通过P53蛋白诱导人乳腺癌细胞MCF-7走向凋亡。还有研究[33]发现血根碱(SAN)能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖，其机制可能是通过升高细胞内活性氧(ROS)水平激活Caspase级联反应，进而促进细胞凋亡。朴丽花等[34]研究发现，人参皂甙Rg3可明显下调肿瘤组织proCaspase-3和proCaspase-9蛋白表达水平，其机制可能为活化癌组织Caspase-3和Caspase-9而诱导细胞凋亡。Won等[35]发现三氧化二砷(As2O3)联合衣霉素(TM)在诱导人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡方面有协同作用，使TM诱导的ERS细胞凋亡途径中Caspase-12凋亡通路发生了改变，而TM可逆转As2O3的促增殖作用为抑制增殖和促进凋亡效应。徐正阳等[36]利用欧前胡素(IMP)上调T-47D细胞中DR5的表达成功促进了肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的线粒体途径凋亡。另外，有研究[37]称银杏叶提取物(EGB)能增强MCF-7细胞 Caspases-3 蛋白的表达。此外，研究[38-39]发现阿法替尼不但可以通过抑制EGFR/PI3K/AKT通路信号转导阻滞乳腺癌细胞于G0/G1期，阻断乳腺癌细胞的增殖，还能促进乳腺癌细胞Caspase-3及PARP的剪切，进而通过Caspase途径促进细胞凋亡。

4 结 语

虽然目前研究发现对乳腺癌有效的药物较多，但患者接受治疗后的效果却并非十分理想。因此，在医疗技术不断发展革新的当下，除了不断寻找新的治疗途径之外，可能更应该把乳腺癌的治疗看作是一个针对整体的治疗，最终目的是诱导乳腺癌细胞的加速凋亡。不同凋亡分子途径之间的相互作用及精准的调控方式将是未来乳腺癌治疗研究的重中之重。