长链非编码RNA AC090809 在人肝癌细胞系中的表达及对Huh7细胞增殖凋亡调控作用观察

陈雪纯，郭梦雅，邵晓雯，黄佳宁，张宁，李咏梅

1 天津医科大学基础医学院遗传学系，天津300070；2 天津医科大学基础医学院病原生物学系

肝细胞肝癌（HCC）是当今世界上最为常见的恶性肿瘤之一，我国每年有38.3 万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的50%以上［1］。男性肝癌发病率高于女性肝癌发病率，居肿瘤总发病率的第四位，致死率居于恶性肿瘤死亡率第三位，总生存率仅为36.9%。如何阻止早期HCC 患者术后复发及肿瘤肝内播散，或使无法手术切除的晚期HCC 患者肿瘤控制在局部以实现带瘤生存，是目前国内外研究的热点［2］。长链非编码RNA（lncRNA）是指长度超过200 个核苷酸的RNA 分子，其上没有编码蛋白的阅读框［3］。虽然lncRNAs 不能编码蛋白质，但在不同组织和发育阶段lncRNAs 的表达具有特异性，说明lncRNAs 具有重要生物学意义。越来越多的研究［4］表明，lncRNAs 通过调节染色质重构、转录和转录后水平基因表达等机制，在细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等方面发挥着重要作用。我们前期研究中通过分析癌症基因组图谱（TCGA）数据库中HCC 临床样本发现，位于8 号染色体上的一条lncRNA AC090809在HCC 组织中低表达，AC090809 高表达的HCC 患者的生存时间要远长于低表达AC090809 的HCC 患者，表明AC090809 高表达水平可能与患者预后良好相关联，提示AC090809 可能与HCC 发生发展有关，但AC090809 生物学功能未见报道。2019年10月—2020年12月，本研究观察了lncRNA AC090809在不同转移能力的人肝癌细胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3中的表达及对Huh7增殖凋亡的调控作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人肝癌细胞系Huh7细胞购自日本研究生物资源收集细胞库，MHCC97L 和HCCLM3细胞来源于复旦大学汤钊猷院士实验室。Trans 1-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。DMEM 培养基、胰酶、胎牛血清，Opti-MEM 均购自于美国Gibco公司；转染试剂Lipofectamine 2000、细胞凋亡FITC-Annexin V and PI Apoptosis、反转录ueIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis、实时荧光定量AugeGreenTM qPCR Master Mix等试剂盒均购自苏州宇恒生物科技有限公司；TRIzol购自美国In⁃vitrogen 公司；引物合成、shRNA所用表达质粒载体合成自苏州金唯智生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自以色列Biological Industries公司。

1.2 不同转移能力的人肝癌细胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 中AC090809 检测 人肝癌细胞系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 均使用含10%血清的DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2条件下在恒温培养箱中进行培养，当细胞密度达到90%～95%时，弃去细胞培养液，用PBS 冲洗2～3 次，加入TRIzol 裂解液1 mL，转移至1.5 mL去酶去菌的EP管中，室温静置2～5 min，加入氯仿后用力涡旋震荡15 s，待其充分乳化至溶液呈乳白色，室温静置2 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，吸取上层水相于新的去酶去菌1.5 mL EP 管中，加入相同体积的异丙醇，将1.5 mL EP 管上下颠倒混匀5 次，室温静置10 min，4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，弃上清，管底沉淀即为RNA。去提取的RNA 加入75%乙醇洗2次，4 ℃条件下7 500 r/min 离心5 min，吸弃上清，沉淀于超净工作台内室温干燥2～5 min，加入20 µL用DEPC 处理 过的水溶 解RNA，取1 µL RNA 用Nanodrop测量浓度及RNA纯度。取1µg模板RNA、4 µL ueIris ⅡRT MasterMix（5×）、1 µL dsDNase 于新的EP 管中，将RNase-free water 加至20µL。将以上体系轻轻混匀，瞬时离心后，在PCR 仪上进行反转录：37 ℃孵育2 min，55 ℃孵育10 min，85 ℃孵育10 s。，根据反转录得到的cDNA 浓度进行计算，按照说明书的比例将PCR 试剂与cDNA 加入新的EP 管中混匀，上机进行实时荧光定量PCR 检测。PCR 反应条件为：94 ℃、5 min，94 ℃、30 s，60 ℃，30 s，72 ℃、2min，35 个循环，72 ℃、10min。引物序列如下：AC090809 上 游 引 物 为5′-CGGCATCACG⁃CATTCGAATTTA-3′，游引物为5′-AGTGCCACAC⁃CATCAACAGT-3′，内参18s-rRNA 上游引物为5′-GCTTAATTTGACTCAACACGGGA-3′，下游引物为5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC-3′。 采 用2－ΔΔCT法计算AC090809 mRNA相对表达量。

1.3 Huh7 细胞的AC090809 降表达shRNA 转染及转染后细胞增殖、凋亡情况观察

1.3.1 Huh7 细 胞 的AC090809 降 表 达shRNA 转染、分组及验证 在细胞室超净台内用EP管配制以下转染体系：Opti-MEM 低血清培养基250 µL、目的质粒（AC090809 降表达质粒sh-AC090809 或对照质粒sh-NC）5µL、转染试剂15µL。轻柔混匀后，室温静置20 min。将以上体系缓慢滴加到细胞密度70%～90%的Huh7 细胞中，上下左右摇晃混匀培养液与转染体系，放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养6 h后，分别补加3 mL DMEM 培养液，待细胞转染48 h 后，将6 孔板中的细胞进行消化，加入含3 µg/mL 嘌呤霉素的DMEM 培养液重悬，传代至10 cm 培养皿中。至未转染的空白对照细胞全部死亡时停止药物筛选，并使用1.5µg/mL 含嘌呤霉素的DMEM 培养基维持培养。其中，转染AC090809降表达质粒sh-AC090809 的Huh7 细胞记为降表达组，转染对照质粒sh-NC 的Huh7 细胞记为对照组，参照“1.2”方法检测转染后两组细胞中AC090809的相对表达量。

1.3.2 转染后两组Huh7细胞增殖能力观察 采用CCK-8 实验。分别取100 µL 两组细胞悬液至96 孔板中，每孔接种1 000 个细胞。将培养板在37 ℃、5% CO2培养箱预培养24 h，向每孔加入100 µL CCK-8 溶液，将培养板在培养箱内孵育24、48、72 h后，用酶标仪测定在450 nm 处各个孔的OD 值，以OD值代表细胞增殖能力。

1.3.3 转染后两组Huh7细胞凋亡情况观察 使用流式细胞仪。取2 组细胞接种于24 孔板中，待细胞密度达到80%左右时，PBS 轻柔冲洗两遍，加入37 ℃的胰酶消化1 min，加入含10%血清的培养基终止消化，室温1 000 r/min 离心3 min，冰PBS 缓冲液洗两遍，加入1×Annexin V 结合缓冲液100 µL 将细胞重悬，然后每管加入FITC -Annexin V、PI 各5 µL，轻轻混合均匀，室温避光静置30 min，每管加入200 µL 的1×Annexin V 结合缓冲液，混合均匀上机，用流式细胞仪检测两组细胞早期凋亡数、晚期凋亡数。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料以±s表示，三组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用student-t检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Huh7、MHCC97L、HCCLM3 细胞中AC090809相对表达量比较 Huh7、MHCC97L、HCCLM3 细胞中AC090809 的相对表达量分别为0.96 ± 0.08、0.08 ± 0.04、0.03 ± 0.01，两两比较，P均<0.05，提示不同转移能力的HCC 细胞中AC090809 相对表达量不同，且AC090809在Huh7细胞中表达量最低。

2.2 转染后两组Huh7 细胞中AC090809 相对表达量比较 降表达组Huh7细胞中AC090809相对表达量为0.16±0.03，对照组为1.01±0.07，两组相比，P<0.05，提示降表达AC090809的Huh7细胞模型成功建立。

2.3 转染后两组Huh7细胞增殖能力比较 降表达组培养24、48、72 h 时的OD 值分别为2.31 ± 0.08、4.18 ± 0.09、8.22 ± 0.07，对照组培养24、48、72 h时的OD 值分别为2.10±0.06、2.64±0.08、6.62±0.20，两组相比，P均<0.05。

2.4 转染后两组Huh7细胞凋亡情况比较 降表达组细胞早期凋亡数、晚期凋亡数分别为（222.72 ±11.61）个、（111.63±13.34）个，对照组细胞早期凋亡数、晚期凋亡数分别为（814.35 ± 11.96）个、（324.51±24.82）个，两组相比，P均<0.05。

3 讨论

HCC 在我国一直以来都是重要健康问题，中国肝癌病例数占全世界总数的55%。肝癌目前主要以手术切除、微创手术、介入手术［6］、局部放疗［7］等为主要治疗手段。尽管近年来HCC诊断方法和手术技术已得到显著改善，但是晚期HCC 患者的5年生存率仍然很低，此现象的主要原因是HCC 具有高转移能力和高复发率［8］。因此，为了提高HCC特别是晚期转移性HCC的临床治疗效果，深入研究阐明HCC细胞恶性生物学行为的分子机制具有非常重要意义。

lncRNAs 是一类不具有编码蛋白能力的长链非编码RNA，起初被人们认为是转录的噪声［9］。随着科学发展，人们逐渐发现lncRNAs 即便不能编码蛋白，但是它可以通过与蛋白、mRNA 之间的相互作用，影响转录、翻译等生物学行为［10］。并且lncRNAs也存在于人类各种肿瘤中，在肿瘤中可以作为分子支架、分子诱饵、分子向导去发挥功能，在一定程度上影响肿瘤的增殖或迁移［11-16］。目前研究较为明确的lncRNAs 尚不多［17］，仍有大量lncRNAs 值得我们继续深入研究。

本研究中的lncRNA AC090809 是一条位于8 号染色体、长度为61 602 bp 且不具备蛋白编码能力的非编码RNA。本实验室前期分析了TCGA 公共数据库中HCC 患者AC090809 表达量情况与患者生存状况与生存时间，结果显示AC090809 基因高表达的肝癌患者的生存时间比AC090809 基因低表达的HCC 患者生存时间长，表明高表达AC090809 与患者的良好预后相关联。TCGA 数据库的分析结果提示我们，lncRNA AC090809 的表达可能与HCC 的发生发展有关。MHCC97L 与HCCLM3 是两株具有相同遗传背景、高转移潜能的人肝癌细胞株，且HC⁃CLM3 的转移潜能更高，肺转移率为100%［18］。Huh7是一株来源于52 岁日本男性高分化肝癌细胞株［19］，其转移能力远低于MHCC97L 与HCCLM3 细胞［20］。因此为了验证我们的猜想，在转移能力依次增强的人 肝 癌 细 胞 系Huh7、MHCC97L、HCCLM3 中 对AC090809 的表达量进行实时荧光定量PCR 实验检测，实验结果显示低转移潜能人肝癌细胞株Huh7细胞中AC090809 的表达水平明显高于高转移潜能人肝癌细胞株MHCC97L 与HCCLM3 细胞，这提示AC090809 可能与HCC 细胞的转移能力相关。因AC090808 在Huh7 细胞中表达量最高，所以我们选择在Huh7 细胞中降表达AC090809 检测AC090809对HCC 增殖能力的影响。接下来我们利用shRNA转染Huh7 细胞，经抗生素筛选获得稳定降表达AC090809 的Huh7 细胞。我们利用稳转的Huh7 细胞进行了CCK-8 实验，CCK-8 结果显示降表达AC090809 对细胞的增殖具有明显的促进作用。最后我们用流式细胞仪检测了FITC-Annexin 与PI 染色的细胞。Annexin V 选择性结合磷酯酰丝氨酸（PS），细胞发生早期凋亡时，PS 会外翻到细胞表面，用绿色荧光探针FITC 标记的Annexin V 可以结合外翻的PS。PI是一种DNA结合染料，常用来染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性细胞中的细胞核。PI经488、532或546 nm的激光激发后呈现红色荧光。流式细胞仪检测结果显示，与对照组细胞相比，降表达组细胞的早期凋亡与晚期凋亡细胞数目明显减少。因此，通过CCK-8 实验和凋亡实验的检测我们发现，降表达AC090809 可以明显促进HCC细胞的增殖、抑制细胞凋亡，以上结果说明AC090809对HCC细胞增殖具有一定抑制作用。

综上所述，AC090809 在转移能力最低的Huh7细胞中表达量最高，并且在HCC 细胞中降表达AC090809会促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。本研究展示了一个与HCC 细胞增殖相关的新的lncRNA，为HCC患者的早期诊断与治疗提供了新的靶点。