miR⁃29c在神经系统的病理生理研究进展

鲁莹 李勃 谢晔 万琪 曾俊伟

遵义医科大学生理学教研室（贵州遵义563000）

微小RNA（miRNAs）是一类保守、内源性的小的非编码RNA（20 ～ 22 个核苷酸），通过与靶基因的3′非翻译区（3′⁃UTR）特异性结合，导致mRNA降解或翻译阻滞，影响关键蛋白合成，从而调控细胞的增殖、凋亡与分化等生物学行为。近年文献报道miR⁃29c 在神经系统中高度表达，且通过作用不同的靶基因，影响各种信号通路，参与多种神经系统疾病，如胶质瘤、神经退行性疾病和脑损伤等发生发展。本文围绕miR⁃29c 与神经系统的病理生理相关研究进展进行综述，以期为临床治疗提供潜在的药物靶点与新思路。

1 miR⁃29c 结构与表达调控

成熟的miR⁃29 家族主要包括miR⁃29a、miR⁃29b 和miR⁃29c 三种miRNAs。生物信息学分析显示miR⁃29 家族成员由不同的前体加工而成，但不同成员间预测的靶基因高度重叠。miR⁃29c 的基因序列位于染色体1q23，基因转录后生成的miR⁃29c前体序列5′端的成熟序列为5′⁃UGACCGAUUU⁃CUCCUGGUGUUC⁃3′，3′端的成熟序列为5′⁃UAG⁃CACCAUUUGAAAUCGGUUA⁃3′。有多种转录因子通过与miR⁃29c 基因启动子中的特异性位点结合并促进其转录，如缺氧诱导因子α（hypoxia⁃in⁃ducible factor⁃α，HIF⁃α），YAP 和PU.1 等。HIF⁃α和YAP 的结合位点分别位于转录起始位点上游2 300 bp 和150 ～ 300 bp［1-2］。DNA 甲基转移酶3a（DNA methyltransferase 3a，DNMT3a）和DNMT3b 可使miR⁃29c 启动子高甲基化进而抑制其转录使表达下降；同时，组蛋白去乙酰化酶3（histone deacet⁃ylase 3，HDAC3）和Zeste 同源物增强子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）与c⁃Myc 可组成共抑制复合体结合至miR⁃29 启动子上抑制其表达［3］。此外长链非编码RNA（lncRNA），如长链非编码XIST 可作为分子海绵，抑制miR⁃29c 的表达［4］。

2 miR⁃29c 在神经系统表达

miR⁃29 家族作为重要的基因表达调控因子，在多种疾病中发挥着重要作用。其中miR⁃29c 在心脏、肝脏、子宫以及肌肉中的表达较低，在大脑和脊髓中的表达水平较高［5］，且主要表达于前额叶皮层、海马、伏隔核、中脑黑质致密部、小脑顶核以及脊髓背角等部位［6-10］。此外miR⁃29c 也表达于背根神经节和视网膜等部位［11-12］。进一步形态学试验观察到miR⁃29c 表达于大鼠海马神经元以及体外培养的大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞、小鼠黑质致密部多巴胺神经元和背根节的神经元细胞［9，11，13］。而且在SH⁃SY5Y 人神经母细胞瘤细胞系、U251 人胶质瘤细胞系、BV⁃2 小鼠小胶质细胞系、PC12 和HT22 小鼠海马神经元细胞系中也可见miR⁃29c 表达［7，14-16］。这些有关miR⁃29c 的形态学研究为深入探讨miR⁃29c 在神经系统的生理功能及其参与神经系统疾病的相关机制奠定了基础。

3 miR⁃29c 参与神经系统的生理功能调节

3.1 miR⁃29c 与神经发育ZOU 等［14］在动物试验中观察到随着大脑的发育，miR⁃29c 的表达也在动态变化中；在胚胎期第15 天小鼠大脑miR⁃29c 表达较低，但在新生第3、5 天大脑miR⁃29c 表达上升10 倍左右，到新生第7 天小鼠大脑miR⁃29c 表达虽有所下降但仍远高于胚胎期。同时PODOLSKA等［17］研究显示，与胚胎期第50 天家猪相比，在成年家猪的大脑皮质和小脑miR⁃29c 的表达分别增加了22 倍和18 倍。XIA 等［12］研究发现在视网膜祖细胞分化过程中，与未分化期相比，中分化期与分化期的miR⁃29c 表达变化也逐渐增加。miR⁃29c 作为转录后调节因子，在神经发育不同阶段调控多种基因在特定的时间与空间顺序中表达，但其具体机制还需未来探索。

3.2 miR⁃29c 维持神经元生长在神经生长因子（NGF）诱导PC12 细胞分化的过程中，张力蛋白同源物基因（PTEN）能够抑制神经元突起的生长并影响其形态；而当PC12 细胞过表达miR⁃29c，可作用于PTEN 的3′⁃UTR 使其表达明显下降，AKT 磷酸化水平上升，轴突膜蛋白标记物生长相关蛋白43（GAP⁃43）表达增加，神经丝蛋白200（NF⁃200）和胶质源性神经营养因子（GDNF）表达均上升，这有利于神经元存活和突起形成生长［14］。

3.3 miR⁃29c 通过调节神经元突触可塑性促进认知功能脑源性神经营养因子（BDNF）表达于大脑皮层、海马等多个脑区，对维持神经元突触可塑性具有重要作用。在大鼠海马神经元，miR⁃29c 作用于DNA 甲基转移酶3（DNMT3）的3′⁃UTR 并抑制其表达，致使BDNF 基因启动子甲基化程度降低从而表达上调，TrkB/Erk 通路激活，促进神经元生长相关蛋白⁃43（GAP⁃43）的表达，对于神经元存活和突触可塑性的维持具有重要作用。在小鼠海马CA1区，BDNF 表达增加促进了GAP⁃43 磷酸化，诱导神经元兴奋性突触后电位（EPSP）幅值增大，引起长时程增强（LTP），突触可塑性增强［13］。在小鼠海马CA3 和齿状回区，miR⁃29c 还可以抑制JAK2/STAT3信号通路激活，IL⁃1β，IL⁃6 和TNF⁃α 等炎症因子产生减少，神经元树突棘与分支数目增加，水迷宫实验结果显示小鼠认知功能得到加强［18-19］。

miR⁃29c 在神经元发育分化、突起生长和突触可塑性等神经系统生理方面发挥关键作用，而深入了解miR⁃29c 在神经系统的生理调节作用可以为后续研究各种神经系统疾病提供有效的理论依据。

4 miR⁃29c 参与神经系统疾病的病变过程

4.1 miR⁃29c 与胶质瘤病变胶质瘤是颅内恶性肿瘤中最常见的类型之一，依据恶性程度划分为WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级。WANG 等［20］报道正常脑组织中miR⁃29c 标记指数（53.7%）明显高于胶质瘤组织（WHOⅠ-Ⅱ级18.9%，WHOⅢ级5.5%，WHOⅣ级1.8%）。同时HUI等［21］检测到胶质瘤患者外周血中miR⁃29c 表达量显著下降，且与肿瘤分化程度呈正相关。可见随着胶质瘤恶性程度增高，瘤体和外周血中miR⁃29c 的表达量不断下降，这提示在肿瘤组织以及外周血中miR⁃29c的表达波动在一定程度上可以反映胶质瘤的恶性程度。LUO 等［15］通过与正常人类星形胶质细胞相比，发现不同的胶质瘤细胞系中（U251、U87、T98G、A172 以及SHG44）miR⁃29c 的表达量均显著降低，并且在具有替莫唑胺（TMZ）耐药性的胶质瘤细胞U251 和U87 中检测到miR⁃29c的表达更进一步降低。另有周景儒等［22］研究显示胶质瘤手术切除后患者血清中miR⁃29c的表达往往比术前要高；而且血清miR⁃29c 高表达患者1年生存率（95%）要比低表达患者（77%）高。在复发性胶质瘤组织中观察到多种miRNA 表达下降，其中miR⁃29c 下降近70%，是降低幅度最大的miRNA。因而可见外周血miR⁃29c 含量变化在一定程度上可作为评价胶质瘤患者预后检测指标。但是血清miR⁃29c 的表达量与胶质瘤患者的性别、年龄、肿瘤位置、病理类型和卡氏功能状态评分（KPS）无相关性。

miR⁃29c 表达下降在胶质瘤发病及病变进程里发挥的作用：（1）影响胶质瘤的增殖速度与侵袭能力：与相邻正常脑组织相比，在原发性胶质瘤组织中miR⁃29c 表达明显下降，与周期蛋白依赖激酶6（cyclin⁃dependent kinase 6，CDK6）的3′⁃UTR 结合减少使其表达上升，导致瘤细胞增殖速度加快。但在体外试验中使U251 和U87 胶质瘤细胞过表达miR⁃29c 后，CDK6 表达减少，细胞周期蛋白D1和E 表达也减少，而CDK 抑制因子p27 和p21 增加，最终使细胞周期阻滞在G1 期，瘤细胞的增殖能力下降；同时作用于MMP⁃2 和VEGF 的3′⁃UTR使其表达明显下调，提示瘤细胞的侵袭迁移和血管再生能力受到显著抑制［20］。（2）影响胶质瘤对替莫唑胺的敏感性：一方面，c⁃Myc/miR⁃29c/REV3L通路参与此效应，在裸鼠颅内原位移植瘤模型中随着原癌基因c⁃Myc 表达上升，通过与miR⁃29c 启动子结合抑制转录从而使其表达下降，下游靶点REVL3 的表达增加，替莫唑胺的疗效降低产生抗药性，裸鼠生存期明显缩短，但沉默c⁃Myc 联合替莫唑胺治疗则瘤体积显著减小，裸鼠生存期相对延长；在抵抗替莫唑胺的U251 胶质瘤细胞中过表达miR⁃29c 后并用替莫唑胺处理，miR⁃29c 通过直接与下游靶点REV3L 的3′⁃UTR 结合使其表达显著下降，γ⁃H2AX 的表达上升，进一步促进替莫唑胺致使的DNA 断裂损伤使胶质瘤细胞中DNA 双链损伤和染色体断裂片段增多，细胞活力下降，caspase⁃3 被激活，凋亡率上升，提示胶质瘤细胞对替莫唑胺重新产生敏感性［15］。另一方面，XIST/miR⁃29c/Sp1/MGMT 通路也参与了胶质瘤对替莫唑胺敏感性降低过程，与正常脑组织对比，胶质瘤组织XIST 表达明显上升，通过特异性“海绵”结合方式使miR⁃29c 表达下降，其下游靶点特化蛋白1（specificity protein⁃1，SP1）和O6⁃甲基鸟嘌呤⁃DNA甲基转移酶（O6 methylguanine⁃DNA methyltransfer⁃ase，MGMT）表达增加；同样，在胶质瘤细胞U251（具有抗替莫唑胺效应）过表达miR⁃29c后，miR⁃29c作用于Sp1 的3′⁃UTR，抑制其表达从而使DNA 失配修复通路的重要蛋白MGMT 和MSH6 的启动子活性下降，U251 无法修复替莫唑胺诱导的碱基失配，从而导致DNA 双链结构破坏，凋亡相关通路被激活，提示胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性加强［23］。以上研究表明，miR⁃29c 与胶质瘤的病理进程密切相关，目前临床上关于胶质瘤对替莫唑胺的耐药性仍是一个棘手问题［24］，未来通过测序技术不断深入研究分子机制挖掘出更有效的靶点，或许可以为临床治疗或药物研发提供新方向。

4.2 miR⁃29c 与阿尔兹海默病（alzheimer disease，AD）ZONG 等［10］研究表明在3 ～ 6月龄APPswe/PSDeltaE9 转基因AD 小鼠的海马组织，miR⁃29c 表达显著升高，但miR⁃29a/b 表达量没有发生改变；而在前额叶皮层miR⁃29c表达显著下降。SORENSEN等［25］通过miRNA 测序发现在AD 患者脑脊液和血清中有多种显著差异表达miRNAs，其中miR⁃29c在表达谱变化中下降程度最高，这提示脑脊液和血清miR⁃29c 含量下降可作为AD 发生发展的关键事件。此外，在AD 小鼠中通过静脉注射慢病毒过表达miR⁃29c 后，认知功能也得到明显改善［19］。有关miR⁃29c 参与AD 进程的分子机制主要有：（1）miR⁃29c/DNMT3/BDNF 信号通路：在AD 患者的脑脊液中miR⁃29c 的表达下降，DNMT3 表达增加，导致BDNF 的基因启动子甲基化水平显著升高；而在大鼠海马神经元过表达miR⁃29c 后，直接作用于DNMT3 的3′⁃UTR 显著降低其表达，随后BDNF 基因启动子甲基化水平降低，BDNF表达升高，TrkB和Erk 磷酸化增强［13］；在神经元的胞质和轴突分布的神经元导向因子3（NAV3）表达下降，神经纤维缠结现象减轻［10］。（2）通过靶向β 位淀粉样前体蛋白裂解酶1（β⁃site amyloid precursor protein cleaving enzyme protein 1，BACE1），影响淀粉样前体蛋白（Aβ）生成：AD患者大脑miR⁃29c表达下降而BACE1和Aβ表达同步上升。同时外源性Aβ作用于SK⁃N⁃SH 和CHP212 人神经母细胞瘤细胞，miR⁃29c 表达随Aβ 浓度增加而下降，其下游靶点TNFAIP1 和NF⁃κB 的表达随Aβ 浓度增加而上升，Bcl⁃2 的表达下降，Bax 与cleaved caspase⁃3 的表达量增加［26］；在SAMP8 小鼠海马区注射miR⁃29c 模拟物后，与BACE1 的3′⁃UTR 结合抑制其表达，PKA/CREB 信号通路被激活，Aβ 表达明显减少，AD 小鼠认知功能障碍得到改善［27］。此外大鼠骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡高表达miR⁃29c 之后将注射到AD 大鼠脑室内，也观察到大脑皮层和海马炎症因子表达下降，BACE1 表达和Aβ 斑块形成减少，Wnt/β⁃catenin 信号通路被激活，AD 大鼠认知功能障碍减轻［28］。

4.3 miR⁃29c 与帕金森症（parkinson′s disease，PD）Hoehn&Yahr 分期（HY 分期）常用于临床评估PD 严重程度，随着分期指数增加病情持续加重。BAI 等［29］用基因组测序证实HY⁃1、HY⁃2 和HY⁃3 期患者血清miR⁃29c 表达下降，HY⁃3 期下降最显著，但脑脊液miR⁃29c 表达变化不明显。miR⁃29c 参与PD 进程的分子机制主要有：（1）miR⁃29c/SP1 通路：MPTP 诱导的PD 小鼠中脑黑质致密部miR⁃29c 表达明显下调，而SP1 表达上升，α⁃突触核蛋白堆积，多巴胺能神经元数量减少；PD 小鼠右侧脑室注射miR⁃29c 激动剂可以作用于SP1 的3′⁃UTR 抑制其表达，可逆转上述损伤效应；而在MPP+处理的SH⁃SY5Y 细胞中过表达miR⁃29c，SP1表达降低［9］。（2）miR⁃29c/NFAT5通路：miR⁃29c直接作用于激活T 细胞核因子5（NFAT5）的3′⁃UTR，抑制胶质细胞活化，炎性小体NLRP3 表达和NF⁃κB激活减弱，导致炎症因子TNF⁃α，IL⁃1β，IL⁃6 以及促凋亡因子caspase⁃3和caspase⁃9表达下降，同时谷氨酸转运蛋白GLT1 和GLAST 表达增加，可以防止谷氨酸过度积累造成神经元损伤［4，16，30］。（3）circ⁃SAMD4A/miR⁃29c/AMPK/mTOR 通路：在MPTP 诱导的PD 动物以及SH⁃SY5Y 细胞模型，均观察到miR⁃29c 表达下降是因为受到源于circSAMD4A 的负向调节；circSAMD4A 基因敲减之后miR⁃29c 表达随即上升，AMPK 磷酸化减弱而mTOR 的磷酸化增强，LC3II 和Beclin 的表达下降，提示MPTP 或MPP+导致的神经元凋亡及自嗜得到缓解［31］。可见，miR⁃29c 通过作用于多个下游靶点参与了AD和PD 等神经退行性疾病的病变环节，但目前并不确定miR⁃29c 发挥作用影响的是这些脑区的哪一类神经元亚群的功能，尚需进一步细化。

4.4 miR⁃29c 与脑损伤创伤性脑损伤患者的前额叶皮层和尾壳核中miR⁃29c 表达均下降［32-33］。在缺血再灌注小鼠海马组织和氧⁃糖剥夺的PC12细胞中均可见miR⁃29c 表达下降，但肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）以及IL⁃1β，IL⁃6 和TNF⁃α 表达增加［6-7］；在脑卒中大鼠脑室内注射miR⁃29c激动剂，通过作用于促分裂原活化蛋白激酶激酶6（Map2k6）、Bak1 以及Birc2 的3′⁃UTR，抑制caspase⁃3 活性和p53 凋亡因子表达，PI3K/AKT 通路被部分阻断，促凋亡因子Bax 和Bak 表达下调，减缓缺血缺氧致使的神经元凋亡［33］。此外，ZHANG 等［34］在软骨素蛋白多糖（CSPGs）介导大脑皮层神经元轴突损伤中发现miR⁃29c 表达上升，通过西地那非提高轴突中环磷酸鸟苷（cGMP）的表达，使miR⁃29c 表达下降，与整合素β1（ITGB1）的3′⁃UTR 结合减少，从而激活ITGB1/FAK/RhoA 信号通路减轻轴突损伤。从这些研究来看，在不同脑损伤类型中，损伤区域miR⁃29c 表达趋势并不完全一致，这有可能是实验模型的差异造成的，但也不排除由于病变时间点或实验方法不同造成实验结果的差异。

5 总结与展望

综上所述，miR⁃29c不仅与神经发育有关，也参与了一些神经系统疾病的发生与发展。在患者的血清或脑脊液中，检测到miR⁃29c 的表达发生了不同程度的改变，这提示miR⁃29c 有可能成为检测或评估某些神经系统疾病进展的特异性标记物。在动物试验中外源性补充miR⁃29c 可以增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，抑制肿瘤细胞增殖；可以作用于DNMT3，BACE1，SP1，NFAT5 等多个下游靶基因抑制其表达，从而减轻神经系统退行性病变。但miR⁃29c在神经系统疾病中的作用并非都是有益的，比如在糖尿病周围神经病变小鼠的背根神经节中miR⁃29c 表达上升，神经元轴突损伤加重［11］；在缺血缺氧大鼠小脑顶核中过表达miR⁃29c的同时大脑梗死区域有所增加［33］。因此，有必要深入研究miR⁃29c 与神经系统疾病中不同靶点的相互关系以及在不同脑区的作用，确定并控制miR⁃29c 表达在合理范围内，这更有助于受损神经元的功能修复。关于此类研究有助于将来研发潜在有价值的小分子核酸药物，并为临床诊治神经系统疾病提供新思路。