一起赛鸽烟曲霉菌病的诊断

薛 聪，范 颖，张文鑫，孟 斌，郭繁霞，孙培明*

（1.临沂大学农林科学学院，山东 临沂 276000；2.临沂科技职业学院，山东 临沂）

为了鉴定门诊遇到的一起以呼吸困难为主要临诊症状，以肺脏、气囊、腹膜等组织器官灰白色粟粒状结节为主要病变的赛鸽是否感染了霉菌，采集病死鸽组织样本进行霉菌的分离培养、菌落形态观察和染色镜检试验，从赛鸽组织样本中分离鉴定到一株烟曲霉菌。烟曲霉菌在高盐察氏琼脂培养基上呈现烟绿色绒毛状、棉絮样丝状菌落。光镜观察可见散在分布的霉菌菌体，每个菌体由分生孢子梗、分生孢子头组成；分生孢子梗光滑，呈微绿色；分生孢子头又包含烧瓶状顶囊、单层辐射状小梗和绿色的球形分生孢子。

鸽曲霉菌病又称鸽曲霉菌性肺炎，是一种真菌性传染病。曲霉菌病主要是由烟曲霉菌和黄曲霉菌这两种病原体引起[1]。鸽曲霉菌性肺炎主要侵犯鸽的呼吸器官导致呼吸障碍，偶尔也侵害眼、肝及脑等组织，典型病变为肺部有黄白色或灰白色的霉菌结节。一般可通过肺部的典型剖检变化对鸽曲霉菌病做初步诊断。但为了确诊和明确具体病原仍需进行曲霉菌的分离鉴定。

1 材料

1.1 样本

山东省某赛鸽养殖场饲养赛鸽约3 000 羽，2020 年6 月鸽群陆续发病，主要以2 月龄的青年鸽为主，发病率约为5 %。病鸽初期表现为精神沉郁、食欲不振、反应迟钝、羽毛蓬乱。随着病程发展，病鸽表现出呼吸困难、张口呼吸有“呼呼”的喘息声。部分病鸽出现下痢，排黄白色或绿色稀便。少数赛鸽眼睛一侧或两侧灰白色浑浊，流浆液性泪液，下眼睑有干酪样凝块。有的病鸽出现头颈扭曲、共济失调等神经症状。严重的病鸽迅速消瘦，继而死亡。发病期间使用了恩诺沙星等抗菌药物，但效果较差，发病数量呈上升趋势。之后使用制霉菌素等抗霉菌药物，配合使用抗菌药物，病情逐步得到控制。

1.2 主要试剂 高盐察氏琼脂培养基（批号HB0234）、营养琼脂培养基（批号HB0109）、营养肉汤培养基（批号HB0108）均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。苯酚、乳酸、甘油等化学试剂均为国产分析纯产品。

1.3 主要仪器 恒温培养箱（型号为 DHP-9082B），购自上海一恒科学仪器有限公司；超净工作台（型号为SW-CJ-2D），购自江苏苏净集团有限公司；高压蒸汽灭菌锅（型号为YXQ-LS-100A），购自上海博讯实业有限公司；显微镜（型号为CX33），购自奥林巴斯有限公司；载玻片、盖玻片均购自江苏世泰实验器材公司。

2 方法

2.1 病理检查 剖检病死赛鸽共10 羽，对各组织器官的病理变化进行观察、记录并拍照。无菌采集肺脏、肝脏、霉菌结节用于后续分离培养。

2.2 霉菌的分离培养 按常规方法取组织样本在制备好的高盐察氏培养基上进行划线分离培养。随后将培养皿倒置在恒温箱里培养，温度设置为28 °C。观察并记录霉菌菌落形态、颜色、质地等。挑取霉菌菌丝接种于新的高盐察氏琼脂培养基中进行纯培养。

2.3 霉菌的染色镜检 待霉菌菌落的生长形态稳定时，用接种环无菌挑取菌落中心或边缘部位少量菌丝，置于滴有乳酸苯酚溶液的载玻片上并混匀，加盖玻片后在显微镜下观察并记录霉菌显微观察结果。

2.4 细菌的分离培养 无菌采集病死鸽的肺脏、肝脏组织，常规方法划线接种于营养琼脂培养基和营养肉汤琼脂培养基，置于37 ℃ 恒温箱培养24 h，观察细菌生长情况。

3 结果与分析

3.1 病理变化 对病死鸽进行剖检，主要病理变化为肺脏表面和内部有灰白色、黄白色的霉菌结节，有的结节相互融合成大的团块。肺组织质地较硬、弹性消失，切开时内容物呈现干酪样、轮层状结构。另外在气囊、腹膜、肠道浆膜等组织器官同样可见针尖至米粒或豆粒大小的霉菌结节。

3.2 霉菌的分离培养 （1）高盐察氏培养基上培养48 h，肉眼观察可见针尖大小的白色绒毛样菌落。培养72 h，菌落形态特征较为明显，肉眼能明显观察到绒毛状、棉絮样丝状菌落，表面呈烟绿色、粉末状。培养96 h，观察到菌落面积变大，边缘均匀、平滑，质地呈丝绒状或发絮状的暗绿色菌落，菌落反面呈黄绿色，初步判定为烟曲霉菌。（2）在洁净载玻片上滴加一滴乳酸苯酚溶液，挑取少量菌丝并与之混匀，置100 倍光学显微镜下观察可见散在分布的霉菌菌体，每个菌体由分生孢子梗和分生孢子头组成。进一步通过400 倍镜检观察，分生孢子梗光滑，呈微绿色。在分生孢子梗茎的顶端具有膨大的分生孢子头，分生孢子头包含状如烧瓶的绿色顶囊、单层辐射状小梗和球形分生孢子，顶囊与分生孢梗茎存在一定角度。分生孢子同样为绿色，呈圆形或卵圆形。

3.3 细菌的分离培养 37 ℃ 恒温箱培养24 h，肺脏、肝脏组织划线接种的营养琼脂培养基、营养肉汤琼脂培养基，均未观察到细菌菌落生长。

4 讨论

4.1 鸽曲霉菌病的流行现状 （1）禽曲霉菌病是鸡、鸭、鹅、鸽子等的一种真菌性疾病，主要特征为霉菌性肺炎，往往呈急性群发性暴发，发病率、死亡率较高[2]。本病主要发生于幼禽，成年禽具有一定抵抗力，近年来中禽与成禽发病有增加的趋势。2018 年6 月，新疆某鸡场的30 日龄麻花鸡发生霉菌性肺炎，病鸡张口呼吸并有呼吸“哨音”，剖检可见肺脏有灰白色粟粒状结节病变，支气管有黄白色干酪样物质堵塞[3]。2014 年3 月，山东省临沂市某养殖场的15 日龄肉鸭发生以呼吸道症状为主要特征的烟曲霉菌病[4]，发病率超过50 %，死亡率约为15 %，剖检可见肺脏和气囊有黄白色或灰白色结节。2019 年6 月，河北省某赛鸽养殖场发生曲霉菌病，以3 月龄的青年鸽为主，主要表现为气喘等呼吸道症状，气囊、肺脏可见霉菌结节[5]。本文报道的赛鸽病例都同样主要表现为呼吸道症状，另外有少数病鸽出现头颈扭曲、共济失调等神经症状。（2）霉菌感染不仅会在感染部位造成局部损伤，还会通过产生毒力较强的霉菌毒素继而造成多组织器官损伤。烟曲霉是曲霉菌属致病性最强的霉菌，除了直接损伤和毒素危害，还能导致感染禽免疫抑制、免疫器官萎缩、免疫机能下降，这不仅影响疫苗免疫效果，也容易继发感染大肠杆菌等病原微生物[6]。尤其是赛鸽，一旦发生曲霉菌病，即使经过治疗恢复健康，也常常会因为比赛成绩不佳而被淘汰，从而造成巨大的经济损失。

4.2 鸽曲霉菌病的诊断与治疗 （1）在生产实践中，通常根据肺脏、气囊等脏器的剖检变化即可诊断为禽曲霉菌病。但由于禽曲霉菌病实质上是一类病，其病原又分为多种曲霉菌，为了确诊和分析病因仍需进行曲霉菌的分离培养与鉴定。临床上引起禽霉菌病的主要病原体为烟曲霉菌，黄曲霉菌较少见，偶尔也可从病料中分离出青霉菌、土霉菌、木霉菌、毛霉菌、米根霉菌等[7]。苏战强等人于2018 年从新疆鸡场的霉菌性肺炎样本内分离到烟曲霉、黄曲霉、米根霉，并且烟曲霉的菌落数量明显多于黄曲霉和米根霉[3]。而在本研究中，从赛鸽中同样分离、鉴定到烟曲霉菌，通过菌落形态、镜检观察，结合临床症状和病理变化，最终确诊为赛鸽烟曲霉菌病。（2）烟曲霉菌广泛分布于自然界，产生孢子的能力强，常存在于霉变饲料、禽舍地面、用具和环境中。Sehar 等研究表明：鸽子密集区的土壤和空气中含有烟曲霉等真菌的孢子[8]。Julman 等对鸽子饲养场中的土壤进行真菌筛查，结果从含有大量鸽子排泄物的土壤中分离得到了多种致病真菌，其中烟曲霉菌所占比例最高，占比为31.1 %[9]。防控本病首先应禁止饲喂发霉变质的饲料，杜绝病从口入。其次，搞好环境卫生和消毒工作。彻底清理鸽舍，用火碱、过氧乙酸等消毒剂对地面和墙面进行消毒，并保持饲养场、饲料仓库的干燥卫生。另外，注意合理的鸽群饲养密度，避免应激。在免疫接种、驱虫、训飞以及比赛时，在饲料中适当增加维生素、微量元素以提高赛鸽自身的抵抗力。（3）病死鸽及时进行淘汰和无害化处理，症状较轻者应尽快使用制霉菌素、碘化钾、硫酸铜等抗霉菌药物。配合使用抗生素防止继发感染，同时在饮水中添加葡萄糖、电解多维等营养药增强抵抗力，一般会取得较好的效果。另外，值得注意的是烟曲霉也可以感染哺乳动物和人。2019 年，于宁等报道了一例饲鸽者侵袭性肺曲霉菌感染的病例[10]。2020 年陈肖等报道了一例流感病毒性肺炎合并烟曲霉感染病例[11]，提示饲鸽者与烟曲霉菌感染的关联性，以及烟曲霉对人的危害，应该引起足够重视。