肝外胆管癌差异表达基因相关机制的研究进展

王家兴，申文凤，张乾，冯学敏，任建军

(内蒙古医科大学附属医院，内蒙古自治区 呼和浩特 010050)

0 引言

胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA) 起源于肝内或肝外胆管粘膜上皮细胞，是沿着胆管产生的恶性肿瘤，可以侵犯胆管的任何部位。CCA 分为肝内胆管癌和肝外胆管癌。流行病学调查表明，CCA 占消化道肿瘤的3%。发病率在我国恶性病变中居第四位左右，死亡率居前三位[1]。近年来的疾病的发生率显着攀升[2]，其中肝外胆管癌(Extrahepatic Cholangiocarcinoma，ECC) 占胆管癌的80%～90%[3]，但关于ECC 的发生率尚无大规模的流行病学报告资料。尽管ECC在手术、化疗和放疗等方面取得了进展，但接受根治性治疗的胆管癌患者的5 年生存率仍不到35%[4]。ECC 早期诊断十分困难，发现多晚期，肿瘤患者平均存活期不到12 个月[5]。

全基因组调查和高通量转录组分析的最新进展表明，人类基因组仅包含20000 个蛋白质编码基因，占总基因组的2%[6]。尽管10 到20 倍的基因组序列被转录成长的非编码RNA(lncRNA)，而不是蛋白质编码的RNA[7]。lncRNA 在功能上被定义为长度＞200 个核苷酸(nt)的转录物，没有蛋白质编码的可能性。近年来，lncRNA 和与其相联系的信使RNA 的功能和作用机制越来越受到科学界的关注[8-10]。2011 年，Salmena 等[11]提出了竞争性的内源RNA(competing endogenous RNA，ce-REA)假说。也就是说，lncRNA 可以通过MRE 吸附miRNA，抑制miRNA 的效用，间接可调蛋白质编码基因的表现。因此，肿瘤相关的差异lncRNAs、mRNAs的鉴定及其分子生物学功能的研究可为肿瘤分子生物学研究提供参考。全面了解CCA 差异基因在疾病的诊断和预后中的作用机制，对于明确胆管癌的个体化诊断和预后具有重要意义。本文就ECC 相关基因的研究进行综述，为进一步阐明疾病的发病机制提供理论依据。

1 肝外胆管癌差异LncRNA 的研究现状

LncRNA 的表达水平通常低于编码基因，在分子生物学中已成为肿瘤的重要调控因子，并表现出更多的组织和细胞特异性的表达模式。LncRNAs 的保守性较差，已被证明通过顺式或反式作用机制控制不同水平的基因表达途径。因此，分析lncRNAs 和mRNAs 的共同表现，有助于预测包括癌症在内的各种疾病发展过程中的功能作用，并为最终疾病机制打下基础，在深入了解其机制的基础上，才能发掘与诊断和治疗相关标志物的目标点。据之前的报道[12-13]，lncRNA 可以调节人的恶性肿瘤中的各种生物过程。研究表明lncRNA 可能会影响癌症的发展过程，包括染色质重塑、转录调控、分子运输、炎症反应和氧化应激等。lncRNA 几乎在基因表达的每个阶段都发挥了广泛的调节作用，包括转录，转录后和表观遗传水平。此外，lncRNA 通过多种调节途径对癌症发展和进展起着重要作用的证据越来越多。这些观察结果提示了lncRNA可能的病理生理作用。

1.1 转录组测序结果

一项研究[14]通过在ECC 中进行了lncRNA 和mRNA 表达的转录组分析发现ECC 中差异表达了268 个lncRNA 和459 个mRNA。其中78 例lncRNA 和66mRNA 表达较癌旁组织上调2 倍以上，190 例lncRNA 和393mRNA 表达下调，证实了ECC 与配对癌旁组织lncRNA 表达的差异。共表达mRNA 和lncRNA 的功能分析表明，这些失调的lncRNA 可能与已知的ECC 相关的生物学过程和途径有关。Han 的研究[15]通过全基因组lncRNA 筛选和功能分析，明确lncRNA是否失调并参与关键的炎症途径。报告发现，H19，C3P1，AC005550.3，PVT1 和LPAL2 具有区别胆管癌与正常组织的特征，包括APOC1P1，PVT1 和LPAL2 已被证明在胆管癌发病过程中调节迁移和一些关键炎症基因，提示异性lncRNA可能具有检测胆管癌的潜力。本研究发现，一组lncRNA 在肝内胆管癌和ECC 样本中表现出不同的表达模式，具有不同的临床特性和表现，这表明lncRNA 有可能识别CCA 细胞中癌灶的位置，并区分不同的CCA 亚型，提示lncRNA 可能的调控机制在肝内胆管癌与ECC 之间可能存在差异。

1.2 LncRNA MALAT1

lncRNA Malat1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1，转移相关的肺腺癌转录本1)参与了多种肿瘤类型的发生发展，在多种癌症中观察到MALAT1 的异常表达。本研究[16]考察了MALAT1 在人肝门部胆管癌细胞系和临床肿瘤标本中的作用。结果表明，MALAT1 在肝门部胆管癌组织和细胞系中特异性上调，并与病理肿瘤分期，肿瘤横径大，神经周围浸润有关。敲除MALAT1 抑制CCA 细胞的增殖，迁移和侵袭。此外，趋化因子受体4(chemokine receptor-4，CXCR4)参与了MALAT1 诱导的人肝门部胆管癌的生长，迁移和侵袭。后续研究发现，MALAT1 在调节肝门部胆管癌细胞的生长，迁移和侵袭过程中发挥致癌作用，认为MALAT1 可能是肝门部胆管癌潜在的治疗靶点。Shi Jian 的研究[17]发现肝门部胆管癌患者血浆标本中PCAT1，MALAT1 和CPS1-IT1 的循环显著增加。通过ROC 分析发现三种血浆lncRNA 的ROC 曲线值(AUC)下面积分别为0.784、0.860 和0.677。这三个因素的进一步组合表明更高的疗效(AUC 为0.893；灵敏度为85.5%；特异性为93.2)。本研究表明MALAT1，PCAT1 和CPS1-IT1可作为早期诊断肝门部胆管癌的新的生物标志物。

1.3 LncRNA PCAT1

lncRNA PCAT1(prostate cancer-associated transcript 1，前列腺癌相关转录本1)与多种癌症有关。研究[18]进一步证实PCAT1 在ECC 组织样品和细胞系中上调。转染试验中RNA沉默后PCAT1 的下调降低了ECC 细胞的生长，增加了细胞凋亡。transwell 实验证实PCAT1 能抑制ECC 细胞的迁移和侵袭。此外，PCAT1 是microRNA(miR-122)的竞争性内源，其生物信息学分析和荧光素酶报告基因分析表明PCAT1 通过miR-122 调节Wnt1 表达。此外，PCAT1 下调使糖原合成酶激酶3 水平升高，并显著降低整个细胞裂解液和细胞核部分的-catenin 水平，提示PCAT1 沉默抑制Wnt/-catenin 信号通路。外源表达Wnt1 逆转PCAT1 沉默诱导的ECC 细胞生长抑制的抑制作用。这些结果提示，PCAT1 沉默通过miR-122 抑制和WNT1 表达降低Wnt/-catenin 信号转导抑制ECC进展，提示PCAT1 可能是ECC 相关的潜在治疗靶点。

2 肝外胆管癌相关基因的研究现状

由于胆管癌的发病机制尚不清楚，有学者认为未来的研究重点可以放在胆管癌的基因方面[19,20]。目前研究发现p53、p73、PTEN、K-ras、p16、c-myc、Bcl-2 和RASSF1 等与肝外胆管癌可能具有潜在的联系。

2.1 p53 和p73 基因

p53 基因的分子变化频率是癌症研究中最高的，涉及人类半数以上的恶性肿瘤。研究表明p53 与胆管癌有关，尤其是伴有原发性硬化性胆管炎的胆管癌。Suto 等人[21]分析了52例肝外胆管癌患者的基因。结果表明，肝外胆管癌患者K-ras、p53 和APC 基因突变率分别为9.6%、32.7%和0。这项研究提示了p53 的表达可能与肝外胆管癌的分化程度有关，可作为ECC 的预后指标之一。其中p73 基因和p53 基因具有很大的同源性，经常出现在恶性肿瘤的发生过程中。由于两者的作用有共同点，因此也可以说两者归入同一家族。张志勇等[22]研究分析了41 例肝外胆管癌和10 例胆总管囊肿中p73和p53 的表达。结果表明，p73 基因在人肝外胆管癌的发生发展中起重要作用；另外，由于p73 和p53 的表达是相关的，所以两者之间可能存在有互补作用。另一个与 p53 有较密切关系的是 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，第10 号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白)，属近些年新发现的肿瘤抑制基因。Zhou 等[23]的研究结果表明neoalbaconol(NA)可以通过靶向在10 号染色体上检测到的磷酸盐和PTEN 通过AKT 途径诱导癌细胞死亡，NA通过上调PTEN 抑制人的胆管癌细胞生长，支持PTEN 作为人胆管癌的新型化学治疗的可行性。

2.2 ras 基因

Ras 基因由K-Ras、N-Ras 和H-Ras 组成。引起胆管癌的RAS 基因主要是K-RAS 和N-RAS。肝外胆管癌K-ras 基因点突变可用于区分ECC 与良性胆管病变[24]。K-ras 基因点突变多见于胆管的癌变区或癌前病变，其密码子第12 位点突变，可使其编码的甘氨酸变为天门冬氨酸，而胆管良性病变无K-ras 点突变，提示了ras 基因与肝外胆管癌的潜在相关性。ras 相关底物(Ras correlative C3 creotoxin substrate 1，Rac1)，是内皮细胞功能关键介体的一种小的鸟苷三磷酸酶。Liu 的研究[30]表明在74 例肝外(ECC) 标本和相匹配的相邻正常黏膜，Rac1 在肿瘤组织中的表达明显较高(53.12%)。阻止Rac1 表达可有效抑制癌细胞的生长。Rac1 基因的miRNA 沉默抑制增殖并诱导QBC939 细胞凋亡。其结果提示Rac1 可能是ECC 的新基因治疗靶标。

2.3 p16 基因

p16 基因又称MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994 年由美国率先报道的新型肿瘤抑制基因。定位于9 号染色体q21，编码产物是一种相对分子质量为16×103的蛋白，可直接作用于细胞周期素依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)、CDK6 及周期素 D(cyclin D)等，抑制细胞从G1 期向S 期转变，起到改变细胞周期的作用，被认为是一个重要的肿瘤抑制基因。p16 基因缺失及突变在人类的恶性肿瘤中普遍存在。Li 等[25]的研究结果揭示了Cul4B(Cullin 4B，一种组装泛素连接酶复合物的支架蛋白)的表达可以作为ECC 患者的预后标志物，并发现Cul4B 抑制肿瘤抑制基因P16 的表达，揭示了p16 与ECC 的潜在联系。

2.4 c-myc 基因

c-myc 基因位于8 号染色体q24 上，基因编码的的蛋白产物是p62，能使细胞无限增殖，导致细胞的恶性转化。有研究[26]显示胆管癌细胞中膜内蛋白水解介导的上皮细胞粘附分子胞外域(EpEx)和胞内域(EpICD)的过表达显着增加细胞生长和增殖。其过表达也增加了活性形式的β-连环蛋白和上皮细胞粘附分子(EpCAM)靶基因(例如c-myc 和cyclinD1)的表达水平，同样EpICD 的过表达显着增强了ECC细胞的迁移和侵袭性。表明c-myc 的表达与ECC 细胞迁移、侵袭性等潜在的关系，EpICD 的空间定位及其与β-连环蛋白的相互作用可能在ECC 进展和侵袭中很重要。

2.5 Bcl-2 基因

Bcl-2(B cell lymphoma/leukemia-2) 是从 B 细胞滤泡性淋巴瘤中分离出来的首个被认为有抑制凋亡作用的基因，位于18 号染色体q21 位点。其过度表达已被证实存在于多种肿瘤组织。Eva 等[27]通过免疫组织化学分析了在组织微阵列中组合的128 个肿瘤组织(42 个肝内胆管癌，70 个ECC和16 个胆囊癌)，与正常组织(29 例)相比，CCA 表达p53，bcl-2，bax 和COX-2 的频率更高，数据显示p53，bcl-2，bax和COX-2 在CCA 的发病机制中起重要作用。ECC 中p16，bcl-2 和p53 的差异表达表明，在表型和遗传谱中存在位置相关的差异，进一步支持了P53、p16 以及bcl-2 与ECC 的潜在联系。

2.6 RASSF1 基因

RASSF1 基因是于2000 年Dammnn 于3 号染色体 p21.3 发现的一种新型抑癌基因。因其核苷酸序列C 端与小鼠 RAS 效应蛋白 Nore1 的同源性很高，故得名 RAS association domain family 1(RAS 相关区域家族 1)。陈勇军等[28]检测 48 例ECC 组织及 12 例癌旁组织中的 RASSF1A 表达情况，发现 RASSF1A 在ECC 组织中转录表达缺失阳性率可达 68.75%，并且其缺失与ECC 的转移情况有关。RASSF1 作为一种新型的抑癌基因可能为早期诊治ECC 提供一些新的道路。

3 小结

根据《2020 年NCCN 肝胆肿瘤临床实践指南(V1 版)》提示，肝外胆管癌可将CEA 和CA-199 作为新增的基线检查，但同时提示其特异性较低[29]。目前，转录组分析结果证实ECC 与邻近非癌组织之间存在差异基因表达。这些功能失调基因可能与已知的ECC 相关的生物学过程和途径有关，提示这些基因具有潜在的研究价值。综上所述，转录组测序的研究不仅有效地从基因水平揭示ECC 的病理生理机制，对差异基因的研究也有助于ECC 的早期诊断和治疗。