消渴平合剂对糖尿病肾病db/db小鼠NF-κB、IL-6表达的影响

胡 爽，辛传伟，余霞丽，夏仲尼，羊 波，吕立嵩

(浙江省中医药研究院，浙江省立同德医院 ·浙江 杭州 310012)

糖尿病肾病 (diabetic kidney disease, DKD)为糖尿病多发并且严重的并发症，严重危害人类健康，目前已逐渐成为诱发终末期肾病 (end-stage renal disease, ESRD)的最主要原因，其发病机制和防治策略是目前临床的研究热点[1]。核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)为一多效应转录因子，研究表明，其与炎症因子的产生、免疫反应、细胞外基质积聚、细胞增殖凋亡等密切相关[2-3]，在 DKD发病机制中起重要作用。消渴平合剂是浙江省中医药研究院医院制剂，课题组前期动物实验证实该制剂可减少尿蛋白排泄、抑制TGF-β1的表达[4-5]，但其对NF-κB、IL-6因子表达的影响尚不清楚。因此，本实验拟通过观察消渴平合剂对DKD db/db小鼠NF-κB 和IL-6因子的影响，深入探索其治疗DKD的机理，为临床寻找防治DKD的作用靶点及药物信号通路提供有益的线索。

1 实验材料

1.1 药品 消渴平合剂：由浙江省中医药研究院制剂室生产，由黄芪、生地黄、丹参、山药等组方而成，批准文号：浙药制字Z20100002。厄贝沙坦片：杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司。

1.2 实验动物 挑选11周龄SPF级肥胖型雄性db/db小鼠24只用于实验，体质量(40.74±0.92)g。另选8只db/m小鼠作为空白对照组，体质量(23.35±0.74)g。实验期间观察组及空白对照组小鼠自由饮水、进食。所有实验小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2017-0015。

1.3 实验试剂和仪器 兔多克隆抗体NF-κB p65：沈阳万类生物科技有限公司；IL-6抗体：美国Abcam公司；Trizol Reagent：生工生物工程(上海)股份有限公司；逆转录试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司。Tanon5200全自动化学发光凝胶成像系统：上海天能科技有限公司；全自动生化分析仪：日本HITACHI。

2 实验方法

2.1 实验分组与给药 24只实验用db/db小鼠采取随机数字表法分为3组：模型对照组(MC组，8只)给予生理盐水20 mL/(kg·d)灌胃；厄贝沙坦组(IB组，8 只)予厄贝沙坦17.5 mg/(kg·d)灌胃给药；消渴平组(XKP组，8 只)予消渴平8 g/(kg·d)灌胃给药；空白对照组db/m小鼠(NC组，8 只)，给予生理盐水20 mL/(kg·d)灌胃，以上所有实验用小鼠均连续给药观察8周。

2.2 观察指标及测定

2.2.1 血糖、血脂相关指标检测 所有实验组小鼠在第8周给药后禁食不禁水12 h,采取眼眶静脉取血，分离动物血清，利用全自动生化分析仪检测糖化血清蛋白(Glycosylated serum protein，GSP)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白变化(HDL-C)水平。

2.2.2 肾组织NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA及蛋白表达检测 实验第8周给药后禁食不禁水12 h处死实验用小鼠，留取左肾，分离皮、髓质，置于-80 ℃冰箱中备用。NF-κB p65 mRNA和IL-6mRNA的表达利用荧光定量PCR的方法检测，总RNA提取采用Trizol 法，行逆转录合成，内参基因为β-actin，PCR实验引物设计如表1所示，每个样品做3个复孔，实验数据采用 2-△△CT法进行汇总分析。肾脏NF-κB p65蛋白、IL-6蛋白的表达采用Western blot 法检测，称取左肾组织50 mg，严格按试剂盒说明书进行操作，收集蛋白，进行电泳，然后行转膜、封闭，一抗、二抗孵育，利用Image Lab软件对各实验检测条带进行比较分析。

表1 荧光定量PCR实验引物设计表

3 结果

3.1 消渴平对db/db小鼠糖化血清蛋白GSP水平的影响 见表2。

表2 各组小鼠GSP水平比较

3.2 消渴平对db/db小鼠血脂水平的影响 见表3。

表3 各组小鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C水平的比较

3.3 消渴平对db/db小鼠肾组织NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA表达的影响 见表4。

表4 各组小鼠肾组织NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA表达的比较

3.4 消渴平对db/db小鼠肾组织NF-κB p65、IL-6蛋白表达的影响 见表5，图1。

表5 各组小鼠肾组织NF-κB p65、IL-6蛋白表达的比较

图1 各组小鼠肾组织NF-κB p65、IL-6蛋白表达的Western blot电泳图

4 讨论

糖尿病肾病(DKD)的具体发病机理非常复杂，目前还不十分明确。有研究发现，在DKD患者中，其外周血NF-κB表达水平与尚未发生并发症的糖尿病患者及健康人群相比有显著差异[6]；提示核因子NF-κB在DKD的发病机制中发挥重要作用，抑制NF-κB相关信号通路的表达是DKD重要的治疗方向。NF-κB是进化高度保守的 Rel家族蛋白，调控参与多种炎症、免疫反应、细胞凋亡及癌症基因表达[7]。NF-κB的序列机构特点决定了其各个亚型必须形成二聚体才可发挥生物学作用，NF-κB p65是最常见的二聚体之一。

白介素6(IL-6)是一种炎性反应的启动因子，其同时具有抗炎和促炎的作用[8]。在 NF-κB信号通路中包含TNF-α、IL-6及IL-8等相关的细胞因子，NF-κB的活化可增强IL-6的基因转录，使IL-6产生和释放增多，诱导炎症信号放大；因此， IL-6基因的变化可反映NF-κB信号通路的激活[9]。

本实验通过研究发现，相比db/m小鼠，模型组db/db小鼠的肾组织NF-κB p65蛋白、IL-6蛋白以及NF-κB p65 mRNA、IL-6 mRNA的表达均明显升高，说明随着DKD病程进展，NF-κB相关信号通路被激活，相关细胞因子水平有逐步升高的趋势，而经过相关药物进行治疗8周后，无论是消渴平组还是厄贝沙坦组均可显著降低NF-κB p65蛋白、IL-6蛋白、NF-κBp65 mRNA、IL-6 mRNA的表达(P<0.05)。

祖国传统医学认为，DKD属消渴病，其病理基础和主要病机是瘀血阻络[10]，因此，在临床中医治疗 DKD，活血化瘀通络中药已成为复方的重要组成部分。本实验采用的消渴平合剂为医院制剂，是省级名中医史奎均遵循祖国中医“消渴”的基础病机，根据多年临床行医经验研发，由于目前针对活血化瘀通络类中药深入的基础研究尚不多见，因此本课题组开展了消渴平合剂干预DKD 的系列基础研究，前期动物实验发现该药可明显降低空腹血糖，增强胰岛素敏感性[4]，本实验通过8周的观察发现，与db/m组小鼠相比，模型组小鼠GSP水平显著升高(P<0.01)，TG、TC、LDL-C水平显著升高(P<0.01)，HDL-C水平显著降低(P<0.01)；说明模型组小鼠出现典型的糖毒性、血脂紊乱。而药物干预8周后，消渴平治疗组小鼠GSP水平显著降低(P<0.05)，TG、TC、LDL-C水平明显降低(P<0.05)，HDL-C水平明显升高(P<0.05)；说明消渴平治疗组小鼠糖毒性以及血脂紊乱得到了明显改善。

总之，本次实验通过观察消渴平对db/db小鼠GSP以及血脂水平的影响，发现消渴平可明显降低db/db小鼠糖化血清蛋白水平，可调节血脂，其具体作用机制可能与降低肾脏NF-κB p65、IL-6基因和蛋白的表达有关，但具体的物质基础及分子机制，尚有待进一步研究。